Einfluss eines neuartigen aromatischen Kohlenwasserstoff-Amphiphils auf Tumorgenese und Metastasierung des Osteosarkoms im murinen Modell

Heimann, Laura Anna Vera (2019): Einfluss eines neuartigen aromatischen Kohlenwasserstoff-Amphiphils auf Tumorgenese und Metastasierung des Osteosarkoms im murinen Modell. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät

Abstract

Auf der tumorzellgerichteten Therapie neoplastischer Erkrankungen ruhen große Hoffnungen der Wissenschaft. Bevor diese jedoch Einzug in die Klinik halten kann, bedarf es aufwändiger Untersuchungen in vitro sowie in vivo. Pires et al. konnten bereits äußerst vielversprechende Ergebnisse während ihrer in vitro-Versuche bezüglich der Wirksamkeit des therapeutischen Agens aKA in Kombination mit einer Osteosarkomzelllinie erzielen. Darauf aufbauend sollte in dieser Arbeit eine erste in vivo-Anwendung des aKA im murinen Modell durchgeführt werden. Zunächst wurde in Vorbereitung dazu die verwendete Osteosarkomzelllinie K7M2 in vitro mit verschiedenen Dosen des aKA getestet. Anschließend sollte das aKA in vivo hinsichtlich seines Einflusses auf Tumorprogredienz, Effizienz und systemische Nebeneffekte evaluiert werden. Zusätzlich sollten aufgrund der bisher geringen Datenlage intraosseäre Sauerstoffdaten generiert werden. Zunächst wurde im Rahmen der in vitro-Versuche der Einfluss verschiedener Dosen des aKA auf die metabolische Aktivität der K7M2-Zellen mittels Viabilitäts-Assay, DNA-Quantifizierung, Mikroskopie und Sauerstoffmessungen untersucht. Im nächsten Schritt erfolgte dann die orthotope Implantation der K7M2-Zellen in die proximale Tibia männlicher C57BL/6J-Mäuse. Nach einer Tumorwachstumsphase von 20 Tagen wurde dann über 14 Tage täglich mit verschiedenen Dosen des aKA behandelt. Von Tag 35 bis zum Versuchsende an Tag 50 erfolgte die Beobachtung der Tiere. Zu den Zeitpunkten Tag 0, 20, 21, 35 und 50 wurden Verlaufskontrollen mittels μCT, Blutentnahme, Histologie der tumortragenden Tibia und Sauerstoffmessung der gesunden Tibia durchgeführt. Analog zu den Versuchen von Pires et al. (Pires et al., 2015) konnte die metabolisch supprimierende Wirksamkeit des aKA auf K7M2-Osteosarkomzellen mit nachgewiesen werden. Der Unterschied war bereits nach 7 Stunden signifikant. Zusätzlich war es möglich eine dosisabhängige Oxygenierung 48 Stunden nach aKA-Exposition nachzuweisen. Im präklinischen murinen Tiermodell konnte eine dosisabhängige Verringerung des totalen Knochenvolumens im Vergleich zur unbehandelten nur Tumorzellen-Gruppe am Tag 50 beobachtet werden. Die Wirkung trat dabei zeitverzögert zum Therapieende ein. Zudem bewirkte die Behandlung mit aKA eine dosisabhängige Erhöhung der Knochenmineraldichte. Histologisch konnten zwischen den mit aKA behandelten Gruppen qualitative Unterschiede hinsichtlich Nekrotisierung und Verkalkung ausgemacht werden, die mit steigender Dosis vermehrt auftraten. Es lagen keine Hinweise auf systemische inflammatorische oder toxische Nebeneffekte vor, lediglich eine reizlose postaurikuläre Alopezie war bei drei Mäusen zu beobachten. Mit aKA behandelte Tiere wiesen höhere VEGF-Plasmalevel auf als unbehandelte Tiere, was auf längere Sicht eine verbesserte Tumorvaskularisierung und damit eine gesteigerte Empfindlichkeit gegenüber hämatogen verabreichten Therapien, wie der Chemotherapie, bedeuten könnte. Intratibiale Sauerstoffmessungen des gesunden kontralateralen Beines zeigten physiologische Werte ohne signifikante Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen. Das aKA gehört damit zu den in vitro und in vivo erfolgreich angewendeten Mitgliedern der EISA (enyzme-induced self assembly)-Familie, in die in den letzten Jahren große Hoffnungen der Präzisionsnanomedizin gesetzt wird. Nach Optimierung und Etablierung des erweiterten murinen Modells könnte der nächste Schritt die Übertragung ins kanine Großtiermodell sein, um die klinische Vergleichbarkeit zum Menschen zu verbessern. Zusätzlich könnten derartige Studien der kaninen Osteosarkomtherapie neue Türen öffnen. Diese Strategie könnte Wegbereiter für eine langersehnte tumorzellgerichtete und schonendere Therapie sein, die Lebensqualität und Überlebenszeiten humaner und kaniner Patienten steigert.

Abstract

Great hopes of science rest on the tumor cell-directed therapy of neoplastic diseases. However, elaborate investigations in vitro and in vivo are required before it can be applied clinically. Pires’ group has already achieved very promising results during their in vitro experiments on the efficacy of the therapeutic agent ACA in combination with an osteosarcoma cell line. Based on this, a first in vivo application of ACA in the murine model was carried out in this work. Initially, the used osteosarcoma cell line K7M2 was tested in vitro with various doses of ACA. Subsequently, ACA was aimed to be evaluated in vivo for its influence on tumor progression, efficiency and systemic side effects. In addition, we planned to generate data on intraosseous oxygen due to the insufficient data situation. First, within the in vitro experiments, the influence of different doses of ACA on the metabolic activity of K7M2 cells was investigated using viability assay, DNA quantification, microscopy and oxygen measurements. The next step involved orthotopic implantation of K7M2 cells into the proximal tibia of male C57BL/6J mice. After a tumor growth phase of 20 days, the mice were daily treated with different doses of ACA for 14 days. From day 35 until the end of the experiment on day 50, the animals were under observation. At day 0, 20, 21, 35 and 50, followup monitoring was performed using μCT, blood collection, histology of tumorbearing tibia and oxygen measurement of healthy tibia. Analogous to the experiments of Pires et al. (Pires et al., 2015), the metabolic suppressing effect of ACA could be demonstrated on K7M2 osteosarcoma cells. The difference was already significant after 7 hours. In addition, it was possible to detect dose-dependent oxygenation 48 hours after ACA exposure. In the preclinical murine model, a dose-dependent reduction in total bone volume compared to the untreated tumor-only group was observed on day 50. The effect occurred with a time delay after the end of therapy. In addition, treatment with ACA caused a dose-dependent increase in bone mineral density. Histologically, qualitative differences in necrosis and calcification could be identified between groups treated with ACA, which increased with higher dose. There was no evidence of systemic inflammatory or toxic side effects, with only mild postauricular alopecia diagnosed in three mice. Animals treated with ACA had higher VEGF plasma levels than untreated animals which could cause improved tumor vascularization in the longer term and thus increased sensitivity to hematogenous therapies such as chemotherapy. Intratibial oxygen measurements of the healthy contralateral leg showed no significant differences between the experimental groups. ACA is one of the members of the EISA (enzyme-induced self-assembly) family that has been successfully applied in vitro and in vivo, in which high hopes of precision nanomedicine have been placed in recent years. After optimization and establishment of the extended murine model, the next step could be the transfer to a canine large animal model to improve clinical comparability to humans. In addition, such studies of canine osteosarcoma therapy could open new doors. This strategy could pave the way for a long-desired tumor cell-directed and more gentle therapy that enhances the quality of life and survival of human and canine patients.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 590 Tiere (Zoologie)
• Fakultäten: Tierärztliche Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 27. Juli 2019
• 1. Bericht­erstatter:in: Meyer-Lindenberg, Andrea