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Prediction and validation of regulatory role of microRNAs in zebrafish (Danio rerio) responses to nanoparticle exposure with in silico and in vitro toxicological approaches
Prediction and validation of regulatory role of microRNAs in zebrafish (Danio rerio) responses to nanoparticle exposure with in silico and in vitro toxicological approaches
The release of engineered nanoparticles as by-product of human activities in the environment can interfere with normal biology and health of the exposed organisms. MicroRNAs have been suggested as potential toxicology biomarkers, however the information about expression and role of microRNA in regulation of signaling pathways in organisms exposed to nanoparticles (NP) is limited. Summary of reported biological and pathological outcomes of NP induced toxicity in zebrafish was followed with in silico analysis of the genes potentially responsible for observed toxicological effects. After identifying relevant genes, we constructed six miRNA-mRNA regulatory networks involved in nanoparticle induced toxicological responses in zebrafish. Based on our prediction and selection criteria, we identified six miRNAs that overlapped in networks with high prediction scores, and were validated by previous mammalian and zebrafish microRNA profiling studies: dre-miR-124, -144, -148, -155, -19a, -223. As the next step, we validated the expression of these six miRNAs in THP-1 human monocytic cell line after the exposure to Polystyrene (PS NPs) and ARS labeled Titanium dioxide nanoparticles (TiO2-ARS NPs). Also, identification of miRNAs expression post exposure to PLGA nanoparticles and E. coli BioParticles was used to exclude potential activation and engagement of miRNAs through phagocytosis or pro-inflammatory specific responses. In our study, miR-155-5p showed the most promise as biomarker for PS NPs and TiO2-ARS NPs induced adverse effects. To determine potential for PS NPs and TiO2-ARS NPs for genotoxicity, time and dose dependent DNA damage profile induced by PS NPs or TiO2-ARS NPs was established by comet assay. Results indicated the severe DNA damage was triggered by both PS NPs and TiO2-ARS NPs. However, we observed that the expression of DNA damage repairing genes was elevated post TiO2-ARS NPs but not post PS NPs exposure, questioning the utility of the comet assay as universal assessment tool for genotoxicity induced by nanoparticles in general. It was observed that after PS NPs exposure the successful transfection of miR-155-5p mimic induced the expression of ATM, TAOK1, TRIP13, and APAF-1 while the expression of ERCC1 was attenuated. The ATM, APAF-1 and RAD51 were strongly activated post TiO2-ARS NPs stimulation in mimic-transfected cells. These observations suggest there is significant involvement of miR-155-5p in PS NPs and TiO2-ARS NPs induced adverse effects., Für den menschlichen Gebrauch entwickelte Nanopartikel geraten auf Grund ihrer Verwendung in die Umwelt und gehen dort unter Umständen adverse Wechselwirkungen mit den biologischen Abläufen und der Gesundheit der angetroffenen Organismen ein. MicroRNAs sind bereits mögliche Biomarker für ähnliche toxikologische Fragestellungen. Es ist jedoch ungeklärt, wie sich microRNA Expressionsmuster und deren Regulation von Signalwegen nach einer Nanopartikel (NP) Exposition verhalten. Nachstehende Untersuchungen wurden daher angestellt: Die biologischen und pathologischen Folgen einer NP induzierten Intoxikation im Zebrafischmodell und daraufhin eine in silico Analyse von relevanten Genen, die potentiell mit toxikologischen Effekten im Zusammenhang stehen könnten. Nach einer Bestimmung dieser relevanten Gene, konnten wir sechs miRNA-mRNA Regelnetzwerke auffinden, die im Zusammenhang mit einer Nanopartikel induzierten Reaktion stehen können. Basierend auf dieser Vorhersage und der so getroffenen Auswahlkriterien war es möglich, diese miRNAs: dre-miR-124, -144, -148, -155, -19a, -223 zu identifizieren, die mit hohen Vorhersagewerten in den Regelnetzwerken auftreten und bereits in vorangegangen Profiling Studien bestätigt wurden. Im nächsten Schritt validierten wir die Expression dieser sechs miRNAs in THP-1 Monozyten nach einer Exposition mit Polystyrol (PS NP) und ARS markierten Titandioxid Nanopartikeln (TiO2-ARS NP). Ebenfalls wurde die miRNA Expression nach einer PLGA Nanopartikel und E. coli Bio-Partikel Exposition untersucht, um eine potentielle Verbindung der miRNA Aktivierung zu Phagozytose Vorgängen oder pro-inflammatorischen Reaktionen ausschließen zu können. Die microRNA miR-155-5p zeigte in dieser Studie das vielversprechendste Potential, um als Biomarker für PS NP und TiO2-ARS NP induzierte negative Effekte nutzbar zu sein. Zur Bestimmung des genotoxischen Potentials einer PS NP und TiO2-ARS NP Exposition wurde zusätzlich ein zeit- und dosisabhängiges DNA Schadensprofil durch einen Comet Assay erstellt. Die Ergebnisse zeigten, dass beide Nanopartikelarten in diesem erhebliche DNA Schäden provozieren. Ebenso konnten wir aber feststellen, dass auf eine TiO2-ARS NP Exposition hin, entsprechende DNA-Reparatur-Gene verstärkt exprimiert wurden, diese Reaktion blieb auf PS NP aber aus. Dieser Widerspruch stellt den Nutzen des Comet Assays als universelles Bewertungswerkzeug für genotoxische Geschehnisse durch Nanopartikel generell in Frage. Nach einer PS NP Exposition von THP 1 Zellen, bei den vorher eine erfolgreiche Transfektion mit einem miR-155-5p Mimic stattgefunden hat, wurde eine vermehrte induzierte Expression von ATM, TAOK1, TRIP13 und APAF-1 festgestellt, während die Expression von ERCC1 gedämpft wurde. Die Gene ATM, APAF-1 und RAD51 wurden auch stark in Zellen aktiviert, die das Mimic enthielten aber TiO2-ARS NP ausgesetzt wurden. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass die mircroRNA miR-155-5p eine signifikante Rolle bei den adversen Auswirkungen spielt, die durch PS und TiO2-ARS Nanopartikel in Organismen provoziert werden.
Nanoparticles; MicroRNA; Zebrafish; Titanium dioxide; Polystyrene; THP-1; Genotoxicity
Hu, Moyan
2019
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Hu, Moyan (2019): Prediction and validation of regulatory role of microRNAs in zebrafish (Danio rerio) responses to nanoparticle exposure with in silico and in vitro toxicological approaches. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

The release of engineered nanoparticles as by-product of human activities in the environment can interfere with normal biology and health of the exposed organisms. MicroRNAs have been suggested as potential toxicology biomarkers, however the information about expression and role of microRNA in regulation of signaling pathways in organisms exposed to nanoparticles (NP) is limited. Summary of reported biological and pathological outcomes of NP induced toxicity in zebrafish was followed with in silico analysis of the genes potentially responsible for observed toxicological effects. After identifying relevant genes, we constructed six miRNA-mRNA regulatory networks involved in nanoparticle induced toxicological responses in zebrafish. Based on our prediction and selection criteria, we identified six miRNAs that overlapped in networks with high prediction scores, and were validated by previous mammalian and zebrafish microRNA profiling studies: dre-miR-124, -144, -148, -155, -19a, -223. As the next step, we validated the expression of these six miRNAs in THP-1 human monocytic cell line after the exposure to Polystyrene (PS NPs) and ARS labeled Titanium dioxide nanoparticles (TiO2-ARS NPs). Also, identification of miRNAs expression post exposure to PLGA nanoparticles and E. coli BioParticles was used to exclude potential activation and engagement of miRNAs through phagocytosis or pro-inflammatory specific responses. In our study, miR-155-5p showed the most promise as biomarker for PS NPs and TiO2-ARS NPs induced adverse effects. To determine potential for PS NPs and TiO2-ARS NPs for genotoxicity, time and dose dependent DNA damage profile induced by PS NPs or TiO2-ARS NPs was established by comet assay. Results indicated the severe DNA damage was triggered by both PS NPs and TiO2-ARS NPs. However, we observed that the expression of DNA damage repairing genes was elevated post TiO2-ARS NPs but not post PS NPs exposure, questioning the utility of the comet assay as universal assessment tool for genotoxicity induced by nanoparticles in general. It was observed that after PS NPs exposure the successful transfection of miR-155-5p mimic induced the expression of ATM, TAOK1, TRIP13, and APAF-1 while the expression of ERCC1 was attenuated. The ATM, APAF-1 and RAD51 were strongly activated post TiO2-ARS NPs stimulation in mimic-transfected cells. These observations suggest there is significant involvement of miR-155-5p in PS NPs and TiO2-ARS NPs induced adverse effects.

Abstract

Für den menschlichen Gebrauch entwickelte Nanopartikel geraten auf Grund ihrer Verwendung in die Umwelt und gehen dort unter Umständen adverse Wechselwirkungen mit den biologischen Abläufen und der Gesundheit der angetroffenen Organismen ein. MicroRNAs sind bereits mögliche Biomarker für ähnliche toxikologische Fragestellungen. Es ist jedoch ungeklärt, wie sich microRNA Expressionsmuster und deren Regulation von Signalwegen nach einer Nanopartikel (NP) Exposition verhalten. Nachstehende Untersuchungen wurden daher angestellt: Die biologischen und pathologischen Folgen einer NP induzierten Intoxikation im Zebrafischmodell und daraufhin eine in silico Analyse von relevanten Genen, die potentiell mit toxikologischen Effekten im Zusammenhang stehen könnten. Nach einer Bestimmung dieser relevanten Gene, konnten wir sechs miRNA-mRNA Regelnetzwerke auffinden, die im Zusammenhang mit einer Nanopartikel induzierten Reaktion stehen können. Basierend auf dieser Vorhersage und der so getroffenen Auswahlkriterien war es möglich, diese miRNAs: dre-miR-124, -144, -148, -155, -19a, -223 zu identifizieren, die mit hohen Vorhersagewerten in den Regelnetzwerken auftreten und bereits in vorangegangen Profiling Studien bestätigt wurden. Im nächsten Schritt validierten wir die Expression dieser sechs miRNAs in THP-1 Monozyten nach einer Exposition mit Polystyrol (PS NP) und ARS markierten Titandioxid Nanopartikeln (TiO2-ARS NP). Ebenfalls wurde die miRNA Expression nach einer PLGA Nanopartikel und E. coli Bio-Partikel Exposition untersucht, um eine potentielle Verbindung der miRNA Aktivierung zu Phagozytose Vorgängen oder pro-inflammatorischen Reaktionen ausschließen zu können. Die microRNA miR-155-5p zeigte in dieser Studie das vielversprechendste Potential, um als Biomarker für PS NP und TiO2-ARS NP induzierte negative Effekte nutzbar zu sein. Zur Bestimmung des genotoxischen Potentials einer PS NP und TiO2-ARS NP Exposition wurde zusätzlich ein zeit- und dosisabhängiges DNA Schadensprofil durch einen Comet Assay erstellt. Die Ergebnisse zeigten, dass beide Nanopartikelarten in diesem erhebliche DNA Schäden provozieren. Ebenso konnten wir aber feststellen, dass auf eine TiO2-ARS NP Exposition hin, entsprechende DNA-Reparatur-Gene verstärkt exprimiert wurden, diese Reaktion blieb auf PS NP aber aus. Dieser Widerspruch stellt den Nutzen des Comet Assays als universelles Bewertungswerkzeug für genotoxische Geschehnisse durch Nanopartikel generell in Frage. Nach einer PS NP Exposition von THP 1 Zellen, bei den vorher eine erfolgreiche Transfektion mit einem miR-155-5p Mimic stattgefunden hat, wurde eine vermehrte induzierte Expression von ATM, TAOK1, TRIP13 und APAF-1 festgestellt, während die Expression von ERCC1 gedämpft wurde. Die Gene ATM, APAF-1 und RAD51 wurden auch stark in Zellen aktiviert, die das Mimic enthielten aber TiO2-ARS NP ausgesetzt wurden. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass die mircroRNA miR-155-5p eine signifikante Rolle bei den adversen Auswirkungen spielt, die durch PS und TiO2-ARS Nanopartikel in Organismen provoziert werden.