Systematics and signalling of Madagascan chameleons of the Calumma nasutum group

Prötzel, David (2019): Systematics and signalling of Madagascan chameleons of the Calumma nasutum group. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

Background Madagascar is famous for its biodiversity and exceptional degree of endemism, especially in chameleons, hosting almost half of the world’s species. The exploration of its species diversity started with the famous Georges Cuvier who described the first Madagascan chameleons in 1829. Since then, the quality of species descriptions and, subsequently, the species concepts have substantially changed. While the first descriptions were based on a few characters of the external morphology only, today the collected specimens are usually DNA barcoded and their taxonomic status is evaluated based on genetic distances as a first step. In doing so, a previous molecular study of the Calumma nasutum group, which are small chameleons with a rostral appendage on the snout tip in most species, resulted in an impressive 33 deep mitochondrial lineages. Only seven of these corresponded to named species leaving 26 lineages as operational taxonomic units (OTUs). In times of DNA based taxonomy and species delimitation algorithms taxonomists face new challenges of how to describe a species and to avoid oversplitting. In this dissertation I evaluate, based on a taxonomic revision of Calumma nasutum group, the significance of mitochondrial lineages for species delimitation and promote micro-computed tomography (micro-CT) as an additional tool for integrative taxonomy. The second part deals with the discovery of the phenomenon of widespread fluorescence in chameleons. Biofluorescence is only rarely found in land vertebrates, so far, but has been reported for several marine organisms where it is used, inter alia, for intraspecific communication. As chameleons also communicate visually, the fluorescent pattern might work as an additional signal for species recognition. Methods and Procedure To describe (or redescribe) species of the Calumma nasutum group, I followed an integrative taxonomic approach incorporating five lines of evidence (for details, see below): External Morphology, micro-CT-scans of the skulls, dice-CT scans of the hemipenes, mitochondrial gene sequences (ND2), and nuclear gene sequences (CMOS). In the Calumma nasutum group a number of species have remained poorly characterized, because their original descriptions date to over a century ago and lack precise locality data, or because the holotype is a juvenile specimen. These species were redescribed here using a combination of micro-CT scans and detailed study of external morphology. With the help of diagnostic characters of the skull, the old type specimens were matched to recently collected and sequenced specimens. Additionally, micro-CT scanning was used for the first time to produce 3-dimensional models of chameleon hemipenes. In preparation for scanning, each hemipenis was removed from the specimen and immersed in iodine solution for several days to enhance the contrast when X-raying this soft tissue. This method is called dice-CT, and the resulting scans provide a more objective and detailed illustration of the hemipenes than the conventional 2-dimensional drawings. Further, sequences of mitochondrial (ND2) and nuclear (CMOS) genes were analysed for most of the new species described here. To provide comparability, access, and fast taxonomic progress, all new species were registered at ZooBank with an LSID number, their sequences were uploaded to GenBank, and all taxonomic acts were published in open access journals. To study fluorescence in chameleons, we used a fluorimeter to measure the excitation and emission spectra and to calculate the quantum yield for the intensity of fluorescence. The distribution of the fluorescent tubercles was recorded with photographs under UV light illumination, and the bony origins of fluorescence were studied using micro-CT and Transmission Electron microscopy of histological sections. Conclusions The taxonomic part or this dissertation resulted in the description of eight new chameleon species, "Calumma emelinae", C. gehringi, C. juliae, C. lefona, "C. ratnasariae", C. roaloko, "C. tjiasmantoi", and C. uetzi (see chapter 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4, 3.1.5), contributing nearly 4% of all known species of the family Chamaeleonidae. Furthermore, one species, C. radamanus (Mertens, 1933) was revalidated, five species, C. boettgeri (Boulenger, 1888), C. fallax (Mocquard, 1900), C. guibei (Hillenius, 1959), C. linotum (Müller, 1924), and C. nasutum (Duméril & Bibron, 1836) were redescribed, and the females of C. vatosoa Andreone, Mattioli, Jesu & Randrianirina, 2001 were described for the first time. Using an integrative taxonomic approach, I showed that current species delimitation algorithms based on mitochondrial gene sequences alone greatly overestimate the actual number of species. Micro-CT proved essential for analysing skull morphology, which resulted more appropriate for species delimitation than some highly variable external characters. Further, this tool enabled to find frontoparietal fenestrae, which are cranial openings of potential adaptive importance found only in chameleon species living at high elevations. Using novel dice-CT imaging, I also analysed hemipenial morphology in minute detail and described a new ornament, the “cornucula gemina”. Finally, the phenomenon of fluorescence in chameleons was discovered in species belonging to eight of the twelve chameleon genera. The optimal excitation wavelength is in the UV-A spectrum at 353 nm, emitting light with wavelengths from 360 nm to 500 nm, with a maximum at 433 nm (blue spectrum). We showed that the fluorescent patterns result from bony tubercles on the skull are species specific, sexually dimorphic, and occur especially in forest living species. Based on these findings, and also because the colour blue is a conspicuous signal in forest habitats, I hypothesize that chameleons use fluorescence as a constant signal for intraspecific communication supplementing their vibrant body-colour language. Further, as-of-yet unpublished examples suggest that fluorescence is more common in squamates and might be an interesting field for further studies.

Abstract

Hintergrund Madagaskar ist bekannt für seine Biodiversität und seine außergewöhnlich hohe Endemismusrate. Dies gilt vor allem für Chamäleons, da auf der Insel beinahe die Hälfte aller Arten weltweit vorkommt. Die Erforschung dieser Artenvielfalt begann mit dem berühmten Georges Cuvier, der die ersten madagassischen Chamäleons im Jahre 1829 beschrieb. Seit damals haben sich die Qualität der Artbeschreibungen und folglich auch das Artkonzept substanziell verändert. Beruhten die ersten Beschreibungen noch auf wenigen Merkmalen der äußeren Morphologie, so werden heutzutage die gesammelten Exemplare gewöhnlich erst sequenziert und ihre Artzugehörigkeit anhand von genetischen Abständen bewertet. Auf diese Weise stellte eine vorangegangene Studie fest, dass die Calumma-nasutum-Gruppe, die aus kleinen Chamäleons mit gewöhnlich einem Nasenfortsatz auf der Schnauze besteht, insgesamt 33 tiefe mitochondriale Linien enthält. Nur sieben davon gehörten zu bereits beschriebenen Arten, wodurch noch 26 Linien als operational taxonomic units (OTUs) übrig blieben. In Zeiten der DNA-geleiteten Taxonomie und der Verwendung von Algorithmen zur Artabgrenzung stehen Taxonomen neuen Herausforderungen gegenüber, eine Art zu beschreiben und ein sogenanntes „oversplitting“ zu vermeiden. In dieser Dissertation bewerte ich am Beispiel der Revision der Calumma-nasutum-Gruppe die Bedeutung von mitochondrialen Linien zur Artabgrenzung und stelle Mikrocomputertomografie (Mikro-CT) als zusätzliches Werkzeug der integrativen Taxonomie vor. Der zweite Teil handelt von der Entdeckung des Phänomens der weitverbreiteten Fluoreszenz bei Chamäleons. Biofluoreszenz wurde bisher nur selten bei Landvertebraten nachgewiesen, ist jedoch bei einigen Meeresorganismen gut bekannt, welche die Fluoreszenz unter anderem zur intraspezifischen Kommunikation nutzen. Da Chamäleons ebenfalls optisch kommunizieren, könnten die Fluoreszenzmuster als zusätzliches Signal zur Arterkennung dienen. Methoden und Vorgehensweise Um Arten der Calumma-nasutum-Gruppe (wieder) zu beschreiben, nutzte ich einen integrativen taxonomischen Ansatz mit fünf Beweislinien (siehe unten im Detail): Äußere Morphologie, Mikro-CT-Scans der Schädel, dice-CT-Scans der Hemipenisse, Sequenzen der mitochondrialen Gene und Sequenzen der Kerngene. Einige Arten der Calumma-nasutum-Gruppe waren bisher wenig charakterisiert, da ihre Originalbeschreibung über einhundert Jahre zurücklag und genaue Typuslokalitäten fehlten oder weil der Holotypus ein Jungtier ist. Diese Arten wurden unter Verwendung von mikro-CT-Scans und genauer Untersuchung der äußeren Morphologie wiederbeschrieben. Mit Hilfe diagnostischer Merkmale des Schädels wurden die alten Holotypen kürzlich gesammelten und sequenzierten Individuen zugeordnet. Zusätzlich wurden zum ersten Mal Mikro-CT-Scans genutzt, um dreidimensionale Modelle von Chamäleonhemipenissen zu entwerfen. Zur Vorbereitung des Scans wurde jeder Hemipenis vom Tier abgetrennt und in Lugolscher Lösung für mehrere Tage eingelegt, um den Kontrast dieses weichen Gewebes beim Röntgen zu erhöhen. Diese Methode nennt sich dice-CT und die resultierenden Scans bieten eine objektivere und detailliertere Darstellung des Hemipenis als die herkömmlichen zweidimensionalen Zeichnungen. Weiterhin wurden Sequenzen von mitochondrialen Genen (ND2) und Kerngenen (CMOS) für die meisten der hier neu beschriebenen Arten analysiert. Um Vergleichbarkeit, weltweiten Zugang und schnellen taxonomischen Fortschritt zu garantieren, wurden alle neuen Arten bei ZooBank unter einer LSID-Nummer registriert, ihre Sequenzen bei GenBank hochgeladen und alle taxonomischen Arbeiten in open-access-Journalen veröffentlicht. Zur Untersuchung der Fluoreszenz bei Chamäleons benutzten wir ein Fluorimeter, um die Anregungs- und Emissionsspektren zu messen und die Quantenausbeute zu berechnen. Die Verteilung der fluoreszierenden Tuberkel wurde mit Fotos unter UV-Beleuchtung dokumentiert und ihr knöcherner Ursprung mit Mikro-CT und Transmissionselektronenmikroskopie der histologischen Schnitten untersucht. Schlussfolgerungen Im taxonomischen Teil dieser Dissertation wurden acht Chamäleonarten neu beschrieben, die beinahe 4% aller bisher bekannten Arten der Familie Chamaeleonidae ausmachen: "Calumma emelinae", C. gehringi, C. juliae, C. lefona, "C. ratnasariae", C. roaloko, "C. tjiasmantoi", und C. uetzi (siehe Kapitel 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4, 3.1.5). Weiterhin wurde eine Art, C. radamanus (Mertens, 1933), revalidiert. Es wurden fünf Arten wiederbeschrieben: C. boettgeri (Boulenger, 1888), C. fallax (Mocquard, 1900), C. guibei (Hillenius, 1959), C. linotum (Müller, 1924), und C. nasutum (Duméril & Bibron, 1836), und die Weibchen von C. vatosoa Andreone, Mattioli, Jesu & Randrianirina, 2001 wurden erstmals beschrieben. Mit Verwendung eines integrativ taxonomischen Ansatzes konnte ich zeigen, dass Algorithmen zur Artabgrenzung, die allein auf mitochondrialen Gensequenzen basieren, die eigentliche Anzahl an Arten deutlich überschätzen. Mikro-CT bewährte sich um die Schädelmorphologie zu untersuchen, welche sich besser zur Artabgrenzung eignete als die sehr variablen äußeren Merkmale. Außerdem konnten mit Hilfe dieses Werkzeugs auch Frontoparietalfenster gefunden werden. Diese Schädelöffnungen wurden nur bei Chamäleons aus Montangebieten nachgewiesen und könnten eine besondere Anpassung an den Lebensraum darstellen. Das neuartige Dice-CT-Verfahren ermöglichte die Hemipenismorphologie im kleinsten Detail zu untersuchen und auch ein neues Ornament, die “cornucula gemina”, zu beschreiben. Schließlich wurde bei Arten aus acht der zwölf Chamäleongattungen das Phänomen der Fluoreszenz entdeckt. Die optimale Anregungswellenlänge liegt im UV-A-Spektrum bei 353 nm und Licht mit Wellenlängen von 360 bis 500 nm, mit einem Maximum bei 433 nm im blauen Spektrum, wird emittiert. Wir konnten zeigen, dass die Fluoreszenzmuster von knöchernen Tuberkeln des Schädels stammen, artspezifisch und sexualdimorph sind und vor allem bei waldbewohnenden Arten vorkommen. Darauf aufbauend und auch, da die Farbe Blau im Wald ein auffallendes Signal darstellt, formuliere ich die Hypothese, dass Chamäleons die Fluoreszenz als konstantes Signal zur intraspezifischen Kommunikation nutzen und damit ihre Farbensprache ergänzen. Nicht-publizierte Beispiele lassen außerdem vermuten, dass Fluoreszenz bei Squamaten weiter verbreitet ist und ein interessantes Gebiet für nachfolgende Studien darstellen könnte.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: biodiversity, mitochondrial lineages, micro-CT, chameleons, Madagascar, biofluorescence, new species
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 25. Juni 2019
• 1. Bericht­erstatter:in: Haszprunar, Gerhard