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Surface-Integrated Fluorescence Correlation Spectroscopy (SI-FCS) for the quantification of transient membrane and surface binding
Surface-Integrated Fluorescence Correlation Spectroscopy (SI-FCS) for the quantification of transient membrane and surface binding
Das Verständnis der komplexen Netzwerke bio-molekularer Wechselwirkungen benötigt die korrekte und präzise Quantifizierung von Bindungskinetiken. Besonders von Bedeutung sind Wechselwirkungen mit Membranen oder membrangebundenen Objekten, da Membranen nicht nur Bindungskinetiken beeinflussen, sondern auch in eine große Menge entscheidender zellulärer Prozesse grundsätzlich eingebunden sind, darunter Prozesse wie Zellteilung, Signaltransduktion, Endozytose, Exozytose oder Zellmigration. Um die korrekte und präzise Quantifizierung von Bindungskinetiken zu ermöglichen, haben wir die oberflächen-integrierte Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (SI-FCS, engl. surface-integrated fluorescence correlation spectroscopy) entwickelt. Die Methode basiert auf der Autokorrelation von zeitlichen Fluoreszenzfluktuationen in einer Sequenz von Bildern, die mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRF-Mikroskopie, engl. total internal reflection microscopy) aufgenommen wurden. SI-FCS kann zuverlässig die Assoziations und Dissoziationsraten von reversiblen Liganden-Rezeptor-Bindungen bestimmen. Die DNA-Hybridisierung kurzer Einzelstränge – bei denen einer auf der Oberfläche immobilisiert ist, während sich der andere, fluoreszent markierte Strang in Lösung befindet – imitierte dabei Liganden-Rezeptor-Systeme und wurde in dieser Arbeit präzise mit SI-FCS vermessen. Systematisch haben wir das Leistungsvermögen und die Limitierungen von SI-FCS untersucht und dabei die photo-induzierte Schädigung von immobilisierten Einzelsträngen als Einschränkung für lange Messzeiten oder hohe Ligandenkonzentrationen bestimmt. Die photoinduzierte Schädigung erfolgt dabei vorwiegend durch reaktive Sauerstoffspezies. In SI-FCS und in DNA-Hybrisierungs-basierter Hochauflösungsmikroskopie (DNA-PAINT) konnten wir diesen Effekt durch das biochemische Entfernen von Sauerstoff vermeiden. In einem parallelen Ansatz zeigen wir ein verbessertes Design für den bindenden DNA-Strang mit einem erhöhten Abstand zwischen dem fluoreszenten Farbstoff und der Bindungssequenz. Die Bestimmung von Bindungszeiten im Millisekunden-Bereich und kürzer mit SI-FCS ist letzlich limitiert durch exakte mathematische Modelle für die Autokorrelationsfunktion, die auch die Diffusion durch das evaneszente TIRF-Feld mit einbeziehen. Basierend auf einem Fluoropolymer mit dem Brechungsindex wässriger Proben, haben wir eine Kalibierungsprobe entwickelt, mit derer die axiale Detektionswahrscheinlichkeit für Moleküle in der TIRF-Mirkoskopie direkt bestimmt werden kann. Dabei haben wir eine tiefer in die Probe eindringende Komponente der TIRF-Anregung in der Objektiv-basierten TIRF-Mikroskopie gefunden, die bisher von der entsprechenden FCS-Theorie unberücksichtigt ist. Schließlich haben wir die praktische Anwendung von SI-FCS auf die Untersuchung von Bindungen an Membranerezeptoren und die Verteilgung von Biomolekülen zwischen Lösung und Membran optimiert. Modelle für die Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung in Kombination mit Diffusion auf der Membran, haben wir in einer DNA-Hybridisierungs-basierten Machbarkeitsstudie verifiziert. Des Weiteren zeigen wir ein modifiziertes Modell der Autokorrelationsfunktion für die Verteilung von Biomolekülen zwischen Lösung und Membran und untersuchen die komplexe Verteilung von Peptiden in Simulationen und Experimenten mit drei unterschiedlichen Modellmembransystemen., Understanding the complex networks of biomolecular interactions requires the accurate and precise quantification of binding kinetics. Interactions with membranes or membrane-bound entities are of particular interest, as membranes do not only influence binding kinetics, but are fundamental to a large set of key cellular processes such as cytokinesis, signalling, endocytosis, exocytosis or cell migration. To enable the accurate and precise quantification of binding kinetics, we developed surface-integrated fluorescence correlation spectroscopy (SI-FCS). This method is based on the autocorrelation of temporal fluorescence fluctuations from a stream of total internal reflection fluorescence (TIRF) images. SI-FCS reliably extracts the association and dissociation rates of reversible ligand-receptor binding. The DNA hybridization of short single-strands – one immobilized on the surface, the other fluorescently labeled in solution – mimicked ligand-receptor systems and was precisely quantified with SI-FCS within this work. We systematically assessed the potential and limitations of SI-FCS and identified the photo-induced damage of immobilized single-strands as a constraint for longer measurement times and high ligand concentrations. The photo-induced damage was predominantly caused by reactive oxygen species (ROS). Not only did we show that this effect can be prevented in SI-FCS and DNA hybridization-based super-resolution microscopy (DNA-PAINT) with oxygen scavenging buffers, but we also presented an improved DNA handle design with increased distance between fluorescent dye and binding sequence. Accessing binding times with SI-FCS in the millisecond range and below is ultimately limited by accurate autocorrelation models incorporating the diffusion through the evanescent TIRF field. Based on a fluoropolymer matching the refractive index of aqueous samples, we designed a calibration slide to directly characterize the axial molecule detection function in TIRF microscopy. We found a penetrating component to the TIRF excitation in objective-type TIRF microscopy, so far unconsidered by the respective FCS theory. Finally, we optimized the implementation of SI-FCS for examining binding to membrane receptors and the partitioning of biomolecules to membranes. We verified models for ligand-receptor interaction in the presence of diffusion in the membrane using a DNA hybridization-based proof-of-concept system. Further, we presented a modified autocorrelation model for the partitioning to membranes and examined the complex partitioning of peptides in simulations and experiments on three different model-membrane systems.
Not available
Blumhardt, Philipp Paul
2019
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Blumhardt, Philipp Paul (2019): Surface-Integrated Fluorescence Correlation Spectroscopy (SI-FCS) for the quantification of transient membrane and surface binding. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
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Abstract

Das Verständnis der komplexen Netzwerke bio-molekularer Wechselwirkungen benötigt die korrekte und präzise Quantifizierung von Bindungskinetiken. Besonders von Bedeutung sind Wechselwirkungen mit Membranen oder membrangebundenen Objekten, da Membranen nicht nur Bindungskinetiken beeinflussen, sondern auch in eine große Menge entscheidender zellulärer Prozesse grundsätzlich eingebunden sind, darunter Prozesse wie Zellteilung, Signaltransduktion, Endozytose, Exozytose oder Zellmigration. Um die korrekte und präzise Quantifizierung von Bindungskinetiken zu ermöglichen, haben wir die oberflächen-integrierte Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (SI-FCS, engl. surface-integrated fluorescence correlation spectroscopy) entwickelt. Die Methode basiert auf der Autokorrelation von zeitlichen Fluoreszenzfluktuationen in einer Sequenz von Bildern, die mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRF-Mikroskopie, engl. total internal reflection microscopy) aufgenommen wurden. SI-FCS kann zuverlässig die Assoziations und Dissoziationsraten von reversiblen Liganden-Rezeptor-Bindungen bestimmen. Die DNA-Hybridisierung kurzer Einzelstränge – bei denen einer auf der Oberfläche immobilisiert ist, während sich der andere, fluoreszent markierte Strang in Lösung befindet – imitierte dabei Liganden-Rezeptor-Systeme und wurde in dieser Arbeit präzise mit SI-FCS vermessen. Systematisch haben wir das Leistungsvermögen und die Limitierungen von SI-FCS untersucht und dabei die photo-induzierte Schädigung von immobilisierten Einzelsträngen als Einschränkung für lange Messzeiten oder hohe Ligandenkonzentrationen bestimmt. Die photoinduzierte Schädigung erfolgt dabei vorwiegend durch reaktive Sauerstoffspezies. In SI-FCS und in DNA-Hybrisierungs-basierter Hochauflösungsmikroskopie (DNA-PAINT) konnten wir diesen Effekt durch das biochemische Entfernen von Sauerstoff vermeiden. In einem parallelen Ansatz zeigen wir ein verbessertes Design für den bindenden DNA-Strang mit einem erhöhten Abstand zwischen dem fluoreszenten Farbstoff und der Bindungssequenz. Die Bestimmung von Bindungszeiten im Millisekunden-Bereich und kürzer mit SI-FCS ist letzlich limitiert durch exakte mathematische Modelle für die Autokorrelationsfunktion, die auch die Diffusion durch das evaneszente TIRF-Feld mit einbeziehen. Basierend auf einem Fluoropolymer mit dem Brechungsindex wässriger Proben, haben wir eine Kalibierungsprobe entwickelt, mit derer die axiale Detektionswahrscheinlichkeit für Moleküle in der TIRF-Mirkoskopie direkt bestimmt werden kann. Dabei haben wir eine tiefer in die Probe eindringende Komponente der TIRF-Anregung in der Objektiv-basierten TIRF-Mikroskopie gefunden, die bisher von der entsprechenden FCS-Theorie unberücksichtigt ist. Schließlich haben wir die praktische Anwendung von SI-FCS auf die Untersuchung von Bindungen an Membranerezeptoren und die Verteilgung von Biomolekülen zwischen Lösung und Membran optimiert. Modelle für die Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung in Kombination mit Diffusion auf der Membran, haben wir in einer DNA-Hybridisierungs-basierten Machbarkeitsstudie verifiziert. Des Weiteren zeigen wir ein modifiziertes Modell der Autokorrelationsfunktion für die Verteilung von Biomolekülen zwischen Lösung und Membran und untersuchen die komplexe Verteilung von Peptiden in Simulationen und Experimenten mit drei unterschiedlichen Modellmembransystemen.

Abstract

Understanding the complex networks of biomolecular interactions requires the accurate and precise quantification of binding kinetics. Interactions with membranes or membrane-bound entities are of particular interest, as membranes do not only influence binding kinetics, but are fundamental to a large set of key cellular processes such as cytokinesis, signalling, endocytosis, exocytosis or cell migration. To enable the accurate and precise quantification of binding kinetics, we developed surface-integrated fluorescence correlation spectroscopy (SI-FCS). This method is based on the autocorrelation of temporal fluorescence fluctuations from a stream of total internal reflection fluorescence (TIRF) images. SI-FCS reliably extracts the association and dissociation rates of reversible ligand-receptor binding. The DNA hybridization of short single-strands – one immobilized on the surface, the other fluorescently labeled in solution – mimicked ligand-receptor systems and was precisely quantified with SI-FCS within this work. We systematically assessed the potential and limitations of SI-FCS and identified the photo-induced damage of immobilized single-strands as a constraint for longer measurement times and high ligand concentrations. The photo-induced damage was predominantly caused by reactive oxygen species (ROS). Not only did we show that this effect can be prevented in SI-FCS and DNA hybridization-based super-resolution microscopy (DNA-PAINT) with oxygen scavenging buffers, but we also presented an improved DNA handle design with increased distance between fluorescent dye and binding sequence. Accessing binding times with SI-FCS in the millisecond range and below is ultimately limited by accurate autocorrelation models incorporating the diffusion through the evanescent TIRF field. Based on a fluoropolymer matching the refractive index of aqueous samples, we designed a calibration slide to directly characterize the axial molecule detection function in TIRF microscopy. We found a penetrating component to the TIRF excitation in objective-type TIRF microscopy, so far unconsidered by the respective FCS theory. Finally, we optimized the implementation of SI-FCS for examining binding to membrane receptors and the partitioning of biomolecules to membranes. We verified models for ligand-receptor interaction in the presence of diffusion in the membrane using a DNA hybridization-based proof-of-concept system. Further, we presented a modified autocorrelation model for the partitioning to membranes and examined the complex partitioning of peptides in simulations and experiments on three different model-membrane systems.