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Die Bedeutung von Polyprolinmotiven für Signalproteine in Escherichia coli
Die Bedeutung von Polyprolinmotiven für Signalproteine in Escherichia coli
Aufgrund seiner außergewöhnlichen stereochemischen Eigenschaften ist Prolin im Vergleich zu allen anderen proteinogenen Aminosäuren ein schlechtes Substrat für die ribosomale Peptidyltransferasereaktion. Bestimmte X(-2)X(-1)-PP-X(+1) Motive (polyP) in der entstehenden Peptidsequenz induzieren einen Translationsarrest, welcher nur durch die Beteiligung des bakteriellen Elongationsfaktors EF-P bzw. dessen Orthologe in Eukaryonten und Archaea kompensiert werden kann. Während die zugrunde liegenden Mechanismen bereits gut erforscht sind, existieren nur wenige Erklärungsansätze zur eigentlichen Bedeutung von polyP Motiven. Die Motive wirken auf zwei Ebenen: als zeitliches Element während des Translationsprozesses, durch die Beeinflussung der intramolekularen Translationsrate und räumlich als strukturelles und funktionelles Element der Proteine selbst. Diese Arbeit beinhaltet eine umfassende Analyse zur Verteilung von EF-abhängigen polyP Motiven in E. coli. Die Motive sind in einer großen Bandbreite verschiedener Proteinfamilien vertreten. Dabei wird deutlich, dass polyP Motive im Widerspruch zur Translationseffizienz stehen und daher unter negativer Selektion stehen. Tatsächlich sind die Motive unterrepräsentiert. Eine Akkumulation in bestimmten Proteinregionen weist auf deren Beteiligung an Translationsinitiation, Domänenfaltung und kotranslationaler Translokation von Membranproteinen hin. Der Schwerpunkt einer experimentellen Untersuchung der Rolle von polyP Motiven wurde auf Signalproteine und insbesondere die Histidinkinase EnvZ gelegt. Dabei zeigte sich, dass die Bedeutung der Motive individuell verschieden ist und differenziert bewertet werden muss. Auch innerhalb derselben Proteinklassen ist eine Generalisierung nicht möglich. EnvZ trägt zwei polyP Motive, welche Protein-Protein-Interaktionen vermitteln. Ein stark translationsverzögerndes IPPPL Motiv in der cytoplasmatischen Domäne ist unabdingbar für die Homodimerisierung des Proteins und damit dessen Fähigkeit zur Signaltransduktion an den zugehörigen Antwortregulator OmpR, der die Expression der Zielgene ompC und ompF reguliert. Das einen moderaten Translationsarrest induzierende periplasmatische VVPPA Motiv ist Voraussetzung für die Bindung des Modulatorproteins MzrA. Eine phylogenetische Analyse zeigt eine Koevolution von MzrA und des polyP Motivs in γ-Proteobakterien auf und untermauert damit diese These. Die stark translationsverzögernden polyP Motive der Histidinkinase EvgS, der Diguanylatcyclase DgcC und der Lon Protease sind von unterschiedlicher Wichtigkeit für die jeweiligen Signalwege betreffende phänotypische Ausprägung. Während eine Substitution des entsprechenden polyP Motivs in EvgS zu einer nichtfunktionellen Proteinvariante führt und vermutlich mit der Signalperzeption interferiert, hat der Austausch der Motive in DgcC und Lon Protease keinen erkennbaren Effekt. Eine durch die starken polyP Motive gewährleistete Limitation der Proteinkopienzahl kann im Fall von EnvZ, EvgS und Lon Protease ausgeschlossen werden. Eine globale Regulation des Translationslevels von Proteinen mit polyP Motiv als Antwort auf verschiedene Stressbedingungen findet in E. coli K-12 nur bedingt statt. Unter anderem weisen Zellen im VBNC Zustand (viable but non-culturable) kein verändertes Expressionsmuster von Proteinen mit polyP Motiv auf, das darauf hinweisen würde. Die Aktivität von EF-P wird in E. coli K-12 durch eine OxyR vermittelte transkriptionelle Regulation von epmA, welches für das EF-P modifizierende Enzym β-Lysyltransferase kodiert, geringfügig an oxydative Stressbedingungen angepasst. Diese Arbeit trägt zum besseren Verständnis der Bedeutung von EF-P abhängigen X(-2)X(-1)-PP-X(+1) Motiven in E. coli bei und offenbart insbesondere am Beispiel von Rezeptorproteinen deren vielseitigen Einsatz als regulatorisches und funktionelles Element. Aufgrund des universalen Charakters von polyP Motiven sind die Schlussfolgerungen dieser Arbeit auch für ein besseres Verständnis deren Auftretens in Proteomen anderer Organismen relevant., Compared to other proteinogenic amino acids, proline is only a poor substrate for the ribosomal peptidyltransferase reaction due to its special stereochemical properties. Certain X(-2)X(-1)-PP-X(+1) motifs (polyP) in the nascent peptide chain induce a translation arrest, which can only be compensated by the participation of the bacterial translation elongation factor EF-P or its archaeal or eukaryotic orthologues, respectively. While the underlying mechanisms are already well described, there exist only few explanatory approaches regarding the significance of polyP motifs. The motifs act on two levels: as temporal element during the translation process, by influencing the intramolecular translation rate and spational, by providing structural and functional elements for the protein itself. This work provides a comprehensive analysis of the distribution of EF-P dependent polyP motifs in E. coli. The motifs are represented in a broad range of different protein families. Their occurence conflicts with translation efficiency, which sets them under selection pressure. Indeed, the motifs are underrepresented. An accumulation in certain protein regions indicates their participation in translation initiation, domain folding and cotranslational translocation of membrane proteins. The focus of the experimental investigation of the role of polyP motifs was layed on signal proteins and especially the histidine kinase EnvZ. The data emphasises, that the role of polyP motifs is individually different and has to be evaluated differentiated. A generalization is not possible, not even for proteins of the same class. EnvZ harbours two polyP motifs, which participate in protein-protein interaction. The cytoplasmic IPPPL Motiv, which induces a strong translation arrest is prerequisite for the homodimerisation of the protein and therefore for its ability to transfer the signal to its cognate response regulator OmpR, that regulates ompC and ompF expression. The periplasmic VVPPA is indispensable for the binding of the modulator protein MzrA. A phylogenetic analysis supports this hypothesis by revealing a coevolution of MzrA and the polyP motif in γ-proteobacteria. The strong stalling polyP motifs of the histidine kinase EvgS, the diguanylate cyclase DgcC and the Lon protease are of different importance for the phenotypic characteristics of the respective signaling cascades. While the substitution of the polyP motif in EvgS leads to a nonfunctional protein variant and interferes presumably with signal perception, its replacement in DgcC and Lon protease does not have any detectable effect. A role of the polyP motifs in copy number control can be excluded for EnvZ, EvgS and Lon protease. In E. coli K-12, polyP motifs are only marginal involved in regulating the translation level of proteins with polyP motif. Amongst others, the expression pattern of proteins in the VBNC state (viable but non-culturable) does not imply any changes. The activity of EF-P is slightly adjusted in response to oxidative stress conditions by OxyR mediated transcriptional regulation of epmA, coding for the EF-P modifying enzyme β-lysyltransferase. This work contributes to a better understanding of the significance of EF-P dependent X(-2)X(-1)-PP-X(+1) motifs in E. coli and reveals their broad effects on regulation and function, especially in receptor proteins. Due to the universal character of polyP motifs, the conclusions of this thesis are relevant for a better understanding of their occurence in proteomes of other organisms.
EF-P, Polyprolinmotive, Tranlsationsarrest, Signalproteine, EnvZ
Motz, Magdalena
2019
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Motz, Magdalena (2019): Die Bedeutung von Polyprolinmotiven für Signalproteine in Escherichia coli. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Aufgrund seiner außergewöhnlichen stereochemischen Eigenschaften ist Prolin im Vergleich zu allen anderen proteinogenen Aminosäuren ein schlechtes Substrat für die ribosomale Peptidyltransferasereaktion. Bestimmte X(-2)X(-1)-PP-X(+1) Motive (polyP) in der entstehenden Peptidsequenz induzieren einen Translationsarrest, welcher nur durch die Beteiligung des bakteriellen Elongationsfaktors EF-P bzw. dessen Orthologe in Eukaryonten und Archaea kompensiert werden kann. Während die zugrunde liegenden Mechanismen bereits gut erforscht sind, existieren nur wenige Erklärungsansätze zur eigentlichen Bedeutung von polyP Motiven. Die Motive wirken auf zwei Ebenen: als zeitliches Element während des Translationsprozesses, durch die Beeinflussung der intramolekularen Translationsrate und räumlich als strukturelles und funktionelles Element der Proteine selbst. Diese Arbeit beinhaltet eine umfassende Analyse zur Verteilung von EF-abhängigen polyP Motiven in E. coli. Die Motive sind in einer großen Bandbreite verschiedener Proteinfamilien vertreten. Dabei wird deutlich, dass polyP Motive im Widerspruch zur Translationseffizienz stehen und daher unter negativer Selektion stehen. Tatsächlich sind die Motive unterrepräsentiert. Eine Akkumulation in bestimmten Proteinregionen weist auf deren Beteiligung an Translationsinitiation, Domänenfaltung und kotranslationaler Translokation von Membranproteinen hin. Der Schwerpunkt einer experimentellen Untersuchung der Rolle von polyP Motiven wurde auf Signalproteine und insbesondere die Histidinkinase EnvZ gelegt. Dabei zeigte sich, dass die Bedeutung der Motive individuell verschieden ist und differenziert bewertet werden muss. Auch innerhalb derselben Proteinklassen ist eine Generalisierung nicht möglich. EnvZ trägt zwei polyP Motive, welche Protein-Protein-Interaktionen vermitteln. Ein stark translationsverzögerndes IPPPL Motiv in der cytoplasmatischen Domäne ist unabdingbar für die Homodimerisierung des Proteins und damit dessen Fähigkeit zur Signaltransduktion an den zugehörigen Antwortregulator OmpR, der die Expression der Zielgene ompC und ompF reguliert. Das einen moderaten Translationsarrest induzierende periplasmatische VVPPA Motiv ist Voraussetzung für die Bindung des Modulatorproteins MzrA. Eine phylogenetische Analyse zeigt eine Koevolution von MzrA und des polyP Motivs in γ-Proteobakterien auf und untermauert damit diese These. Die stark translationsverzögernden polyP Motive der Histidinkinase EvgS, der Diguanylatcyclase DgcC und der Lon Protease sind von unterschiedlicher Wichtigkeit für die jeweiligen Signalwege betreffende phänotypische Ausprägung. Während eine Substitution des entsprechenden polyP Motivs in EvgS zu einer nichtfunktionellen Proteinvariante führt und vermutlich mit der Signalperzeption interferiert, hat der Austausch der Motive in DgcC und Lon Protease keinen erkennbaren Effekt. Eine durch die starken polyP Motive gewährleistete Limitation der Proteinkopienzahl kann im Fall von EnvZ, EvgS und Lon Protease ausgeschlossen werden. Eine globale Regulation des Translationslevels von Proteinen mit polyP Motiv als Antwort auf verschiedene Stressbedingungen findet in E. coli K-12 nur bedingt statt. Unter anderem weisen Zellen im VBNC Zustand (viable but non-culturable) kein verändertes Expressionsmuster von Proteinen mit polyP Motiv auf, das darauf hinweisen würde. Die Aktivität von EF-P wird in E. coli K-12 durch eine OxyR vermittelte transkriptionelle Regulation von epmA, welches für das EF-P modifizierende Enzym β-Lysyltransferase kodiert, geringfügig an oxydative Stressbedingungen angepasst. Diese Arbeit trägt zum besseren Verständnis der Bedeutung von EF-P abhängigen X(-2)X(-1)-PP-X(+1) Motiven in E. coli bei und offenbart insbesondere am Beispiel von Rezeptorproteinen deren vielseitigen Einsatz als regulatorisches und funktionelles Element. Aufgrund des universalen Charakters von polyP Motiven sind die Schlussfolgerungen dieser Arbeit auch für ein besseres Verständnis deren Auftretens in Proteomen anderer Organismen relevant.

Abstract

Compared to other proteinogenic amino acids, proline is only a poor substrate for the ribosomal peptidyltransferase reaction due to its special stereochemical properties. Certain X(-2)X(-1)-PP-X(+1) motifs (polyP) in the nascent peptide chain induce a translation arrest, which can only be compensated by the participation of the bacterial translation elongation factor EF-P or its archaeal or eukaryotic orthologues, respectively. While the underlying mechanisms are already well described, there exist only few explanatory approaches regarding the significance of polyP motifs. The motifs act on two levels: as temporal element during the translation process, by influencing the intramolecular translation rate and spational, by providing structural and functional elements for the protein itself. This work provides a comprehensive analysis of the distribution of EF-P dependent polyP motifs in E. coli. The motifs are represented in a broad range of different protein families. Their occurence conflicts with translation efficiency, which sets them under selection pressure. Indeed, the motifs are underrepresented. An accumulation in certain protein regions indicates their participation in translation initiation, domain folding and cotranslational translocation of membrane proteins. The focus of the experimental investigation of the role of polyP motifs was layed on signal proteins and especially the histidine kinase EnvZ. The data emphasises, that the role of polyP motifs is individually different and has to be evaluated differentiated. A generalization is not possible, not even for proteins of the same class. EnvZ harbours two polyP motifs, which participate in protein-protein interaction. The cytoplasmic IPPPL Motiv, which induces a strong translation arrest is prerequisite for the homodimerisation of the protein and therefore for its ability to transfer the signal to its cognate response regulator OmpR, that regulates ompC and ompF expression. The periplasmic VVPPA is indispensable for the binding of the modulator protein MzrA. A phylogenetic analysis supports this hypothesis by revealing a coevolution of MzrA and the polyP motif in γ-proteobacteria. The strong stalling polyP motifs of the histidine kinase EvgS, the diguanylate cyclase DgcC and the Lon protease are of different importance for the phenotypic characteristics of the respective signaling cascades. While the substitution of the polyP motif in EvgS leads to a nonfunctional protein variant and interferes presumably with signal perception, its replacement in DgcC and Lon protease does not have any detectable effect. A role of the polyP motifs in copy number control can be excluded for EnvZ, EvgS and Lon protease. In E. coli K-12, polyP motifs are only marginal involved in regulating the translation level of proteins with polyP motif. Amongst others, the expression pattern of proteins in the VBNC state (viable but non-culturable) does not imply any changes. The activity of EF-P is slightly adjusted in response to oxidative stress conditions by OxyR mediated transcriptional regulation of epmA, coding for the EF-P modifying enzyme β-lysyltransferase. This work contributes to a better understanding of the significance of EF-P dependent X(-2)X(-1)-PP-X(+1) motifs in E. coli and reveals their broad effects on regulation and function, especially in receptor proteins. Due to the universal character of polyP motifs, the conclusions of this thesis are relevant for a better understanding of their occurence in proteomes of other organisms.