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The role of FtsZ treadmilling and torsional stress for bacterial cytokinesis: an in vitro study
The role of FtsZ treadmilling and torsional stress for bacterial cytokinesis: an in vitro study
In dieser Dissertation studierte ich die „Treadmilling“-Dynamik der GTPase FtsZ in vitro. FtsZ gehört zu den häufigsten Proteinen, die an der bakteriellen Zellteilung beteiligt sind. Da FtsZ in vivo an der Lipid Membran verankert ist und eine ringartige Struktur formt, wurde vermutet, dass FtsZ für den mechanischen Prozess der Zytokinese Einschnürungskräfte ausübt. Mehr noch als zu testen, ob FtsZ Kräfte ausübt, die hinreichend für die bakterielle Zellteilung sind, soll die hier präsentierte Studie vielmehr Eigenschaften von FtsZ Polymeren aufzeigen um den physikalischen Prozess der Einschnürung zu verste- hen. Zuerst habe ich vorherige Konzepte über die Rolle von FtsA als natürliches Ankerprotein in Frage gestellt nach Rekonstituierung von FtsZ auf „Supported Lipid Membranes“ (SLBs). Anders als erwartet konnte ich zeigen, dass die FtsZ-YFP-mts Chimäre autonom an die Membran binden kann und die Proteine sich auf der Membran zu einer ringartigen Struktur zusammensetzen, abhängig von der Dichte der Proteine auf der Membranoberfläche. Dieser Ring weist „treadmilling“ Verhalten auf, welches sich in einer anscheinenden Rotation im Uhrzeigersinn äußert. Bei intermediären Proteindichten von FtsZ-YFP-mts formten sich Ringe und bei hohen Proteindichten formten sich parallel zueinander liegende Filamente in nematischer Anordnung. Ferner scheint die Entstehung der ringförmigen Strukturen, ähnlich der in vivo Situation, eher von der GTPase Aktivität abzuhängen als von spezifischen Protein-Anker Interaktionen. Um den Einfluß von FtsZ auf deformierbare Oberflächen zu untersuchen, habe ich Ver- fahren entwickelt, um FtsZ Ringe an der Außenseite von gigantischen unilamellaren Vesikeln (GUVs) zu rekonstituieren. Nachdem die Vesikel einem osmotischen Schock ausgesetzt wurden um sie deformierbar zu machen, induzierten die FtsZ Ringe durch „Bohr-Kräfte“ nach innen gerichtete Membraneinstülpungen („Membran-Kegel“). Mit den nach innen gerichteten Membraneinstülpungen zeigte FtsZ „treadmilling“ Richtungen sowohl im Uhrzeigersinn, als auch gegen den Uhrzeigersinn. Ferner, um den Einfluß von FtsZ auf zylin- drische Geometrien zu untersuchen, habe ich ein neues Verfahren entwickelt, um längliche, weiche, Membranausstülpungen aus GUVs mit Hilfe optischer Pinzetten zu ziehen. Bei GUVs mit FtsZ Ringen an der Membranaußenseite und nach innen gerichteten Membraneinstülpungen, wurden die weichen mit der optischen Pinzette gezogenen „Lipid-Röhren“ bemerkenswerterweise durch FtsZ in eine 3D-helikale, federartige Struktur transformiert. Diese helikalen Deformationen lassen sich durch Verdrehen eines elastischen Stabes erklären. Zusätzlich verursacht die GTPase Aktivität einen „super-verdrehten“ Zustand der ausgezogenen Lipid Membran, die eine Feder-Kompression verursacht mit Kräften um die 0.6 − 1 pN. Diese GTPase abhängige Feder-Kompression entspricht den Einschnürungen, wenn FtsZ innerhalb von GUVs rekonstituiert wurde. Daher schlage ich vor, dass FtsZ bedingte Einschnürungen durch Torsion erzeugt werden., In this thesis, I studied the treadmilling-dynamic properties of GTP-consuming FtsZ filaments in vitro. FtsZ is the most abundant protein in bacteria cell-division machinery. Since FtsZ filaments are anchored to the lipid membrane to form a ring-like structure, it has been suggested that FtsZ exerts constriction-forces driving the mechanical process of cytokinesis. More than determining whether FtsZ generate forces that suffice bacteria cell division, the here presented in vitro study sheds light on FtsZ polymer properties aiming to understand the physical process of constriction. First, I challenged previous conceptions about the role of FtsA, a natural FtsZ membrane anchor, when FtsZ was reconstituted on Supported-Lipid Membranes (SLBs). Contrary to expected, I found that an autonomous membrane binding chimera FtsZ-YFP-mts self-assembles into treadmilling (clockwise-rotation) ring-like structures as a function of the surface protein density. At intermediate surface densities, FtsZ-YFP-mts formed rings whereas, at high surface densities, filaments exhibited a parallel-nematic arrangement. Moreover, rather than an specific protein-anchor interaction, FtsZ GTPase activity determined the emergence of treadmilling rings as also shown in vivo. To explore the impact of FtsZ on deformable surfaces, I found the conditions to reconstitute FtsZ rings outside Giant Unilamellar Vesicles (GUVs). Once vesicles were deflated (deformable), rings induced drilling-like forces shaping inwards cones. In this cone-geometry, FtsZ showed clockwise/anticlockwise treadmilling directions. Moreover, to investigate the impact of FtsZ on tubular geometries, I implemented a novel technique to pull soft lipid tubes (from GUVs) using optical tweezers. Then, soft tubes were pulled from GUVs displaying (outside) FtsZ rings and inwards deformation. Strikingly, FtsZ transformed the lipid tube into a 3D helical spring-like structure. These helical deformations can be rationalized by twisting an elastic rod. In addition, GTPase activity triggered a super-twisted state causing spring compression and delivering forces around 0.6 - 1 pN. This GTPase dependent spring-compression resulted equivalent to the formation of constriction necks when FtsZ was reconstituted inside GUVs. Therefore, I suggest that FtsZ makes constriction via torsional stress.
FtsZ, Bacteria cell division, treadmilling, torsion, constriction
Ramirez Diaz, Diego Alejandro
2019
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Ramirez Diaz, Diego Alejandro (2019): The role of FtsZ treadmilling and torsional stress for bacterial cytokinesis: an in vitro study. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
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Abstract

In dieser Dissertation studierte ich die „Treadmilling“-Dynamik der GTPase FtsZ in vitro. FtsZ gehört zu den häufigsten Proteinen, die an der bakteriellen Zellteilung beteiligt sind. Da FtsZ in vivo an der Lipid Membran verankert ist und eine ringartige Struktur formt, wurde vermutet, dass FtsZ für den mechanischen Prozess der Zytokinese Einschnürungskräfte ausübt. Mehr noch als zu testen, ob FtsZ Kräfte ausübt, die hinreichend für die bakterielle Zellteilung sind, soll die hier präsentierte Studie vielmehr Eigenschaften von FtsZ Polymeren aufzeigen um den physikalischen Prozess der Einschnürung zu verste- hen. Zuerst habe ich vorherige Konzepte über die Rolle von FtsA als natürliches Ankerprotein in Frage gestellt nach Rekonstituierung von FtsZ auf „Supported Lipid Membranes“ (SLBs). Anders als erwartet konnte ich zeigen, dass die FtsZ-YFP-mts Chimäre autonom an die Membran binden kann und die Proteine sich auf der Membran zu einer ringartigen Struktur zusammensetzen, abhängig von der Dichte der Proteine auf der Membranoberfläche. Dieser Ring weist „treadmilling“ Verhalten auf, welches sich in einer anscheinenden Rotation im Uhrzeigersinn äußert. Bei intermediären Proteindichten von FtsZ-YFP-mts formten sich Ringe und bei hohen Proteindichten formten sich parallel zueinander liegende Filamente in nematischer Anordnung. Ferner scheint die Entstehung der ringförmigen Strukturen, ähnlich der in vivo Situation, eher von der GTPase Aktivität abzuhängen als von spezifischen Protein-Anker Interaktionen. Um den Einfluß von FtsZ auf deformierbare Oberflächen zu untersuchen, habe ich Ver- fahren entwickelt, um FtsZ Ringe an der Außenseite von gigantischen unilamellaren Vesikeln (GUVs) zu rekonstituieren. Nachdem die Vesikel einem osmotischen Schock ausgesetzt wurden um sie deformierbar zu machen, induzierten die FtsZ Ringe durch „Bohr-Kräfte“ nach innen gerichtete Membraneinstülpungen („Membran-Kegel“). Mit den nach innen gerichteten Membraneinstülpungen zeigte FtsZ „treadmilling“ Richtungen sowohl im Uhrzeigersinn, als auch gegen den Uhrzeigersinn. Ferner, um den Einfluß von FtsZ auf zylin- drische Geometrien zu untersuchen, habe ich ein neues Verfahren entwickelt, um längliche, weiche, Membranausstülpungen aus GUVs mit Hilfe optischer Pinzetten zu ziehen. Bei GUVs mit FtsZ Ringen an der Membranaußenseite und nach innen gerichteten Membraneinstülpungen, wurden die weichen mit der optischen Pinzette gezogenen „Lipid-Röhren“ bemerkenswerterweise durch FtsZ in eine 3D-helikale, federartige Struktur transformiert. Diese helikalen Deformationen lassen sich durch Verdrehen eines elastischen Stabes erklären. Zusätzlich verursacht die GTPase Aktivität einen „super-verdrehten“ Zustand der ausgezogenen Lipid Membran, die eine Feder-Kompression verursacht mit Kräften um die 0.6 − 1 pN. Diese GTPase abhängige Feder-Kompression entspricht den Einschnürungen, wenn FtsZ innerhalb von GUVs rekonstituiert wurde. Daher schlage ich vor, dass FtsZ bedingte Einschnürungen durch Torsion erzeugt werden.

Abstract

In this thesis, I studied the treadmilling-dynamic properties of GTP-consuming FtsZ filaments in vitro. FtsZ is the most abundant protein in bacteria cell-division machinery. Since FtsZ filaments are anchored to the lipid membrane to form a ring-like structure, it has been suggested that FtsZ exerts constriction-forces driving the mechanical process of cytokinesis. More than determining whether FtsZ generate forces that suffice bacteria cell division, the here presented in vitro study sheds light on FtsZ polymer properties aiming to understand the physical process of constriction. First, I challenged previous conceptions about the role of FtsA, a natural FtsZ membrane anchor, when FtsZ was reconstituted on Supported-Lipid Membranes (SLBs). Contrary to expected, I found that an autonomous membrane binding chimera FtsZ-YFP-mts self-assembles into treadmilling (clockwise-rotation) ring-like structures as a function of the surface protein density. At intermediate surface densities, FtsZ-YFP-mts formed rings whereas, at high surface densities, filaments exhibited a parallel-nematic arrangement. Moreover, rather than an specific protein-anchor interaction, FtsZ GTPase activity determined the emergence of treadmilling rings as also shown in vivo. To explore the impact of FtsZ on deformable surfaces, I found the conditions to reconstitute FtsZ rings outside Giant Unilamellar Vesicles (GUVs). Once vesicles were deflated (deformable), rings induced drilling-like forces shaping inwards cones. In this cone-geometry, FtsZ showed clockwise/anticlockwise treadmilling directions. Moreover, to investigate the impact of FtsZ on tubular geometries, I implemented a novel technique to pull soft lipid tubes (from GUVs) using optical tweezers. Then, soft tubes were pulled from GUVs displaying (outside) FtsZ rings and inwards deformation. Strikingly, FtsZ transformed the lipid tube into a 3D helical spring-like structure. These helical deformations can be rationalized by twisting an elastic rod. In addition, GTPase activity triggered a super-twisted state causing spring compression and delivering forces around 0.6 - 1 pN. This GTPase dependent spring-compression resulted equivalent to the formation of constriction necks when FtsZ was reconstituted inside GUVs. Therefore, I suggest that FtsZ makes constriction via torsional stress.