Molecular force measurements in desmosomes

Cost, Anna-Lena (2019): Molecular force measurements in desmosomes. Dissertation, LMU München: Fakultät für Chemie und Pharmazie

Abstract

Desmosomes are cell–cell adhesion sites especially important in heart and skin tissues. Both tissues are exposed to mechanical stress and desmosomes are essential for stable cell–cell adhesion but whether and how forces act on desmosomes was unclear. Here, a desmoplakin tension sensor was developed reporting on molecular forces experienced by desmoplakin, which is essential for the connection to the intermediate filament cytoskeleton. Tension measured with the desmoplakin tension sensor can therefore also serve as a proxy for forces transduced across desmosomes towards the intermediate filament cytoskeleton. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM)-based Förster resonance energy transfer (FRET) measurements of the desmoplakin tension sensor revealed the absence of desmoplakin forces during the formation of desmomes in keratinocytes. Forces are experienced by desmoplakin, however, on very soft substrates, where the substrate stiffness is in the range of the intermediate filament stiffness. Furthermore, desmosomes are transiently loaded in response to external mechanical stress. The stress-induced loading depends on the magnitude and orientation of the applied tissue deformation. These observations suggest that desmosomes act as stress absorbers and evolved in mammalian tissues to complement adherens junctions especially in more extreme situations. Next to the development and experiments with the desmoplakin tension sensor, the fluorescence lifetime analysis and merge software (FLAMES) was developed. The software provides an automated data analysis pipeline for FRET-based tension sensor experiments measured with FLIM. FLAMES thereby improves the estimation of lifetimes from photon count curves for the signal of interest. Moreover, FLAMES also allows the determination of the relative amount of molecules under tension, which provides a new way for the analysis of tension sensor experiments.

Abstract

Desmosomen sind Zellkontakte zwischen benachbarten Zellen und besonders wichtig im Herzen und in der Haut, die starker mechanischer Belastung ausgesetzt sind. Für eine stabile Zelladhäsion sind Desmosomen unerlässlich, aber es war bisher nicht bekannt ob Desmosomen direkt an der Kraftweiterleitung beteiligt sind. In dieser Arbeit wurde ein Desmoplakin-Kraftsensor entwickelt, der die Kraft über Desmoplakin ausliest. Desmoplakin ist ein essentieller Bestandteil von Desmosomen und bindet an Intermediärfilamente, welche ein wesentlicher Bestandteil des Zytoskeletts sind. Die Kraft über Desmoplakin kann daher auch als Näherung dienen für die Kraft, die über Desmosomen zum Zytoskelett weitergeitet wird. Um den Kraftsensor auszulesen, wurde die Effizienz des Förster-Resonanzenergietransfers (FRET) mit Hilfe von Fluoreszenzlebensdauermessungen (engl. FLIM) bestimmt. Diese Experimente zeigten, dass bei der Bildung von Desmosomen keine Kraft über Desmosomen ans Zytoskelett weitergeleitet wird. Wenn sich die Keratinozytenzellschicht allerdings auf einem sehr weichen Untergrund befindet, wird Kraft an Desmosomen gemessen. Im Unterschied zu den Experimenten auf festeren Untergründen ist die Umgebung in dieser Situation etwa genauso weich wie die Intermediärfilamente. Außerdem sind Desmosomen unter Kraft, wenn sie akut extern mechanisch belastet werden und zwar in Abhängigikeit von der Stärke und Orientierung der externen Belastung. Diese Beobachtungen unterstützen ein Model in dem Desmosomen in Säugetieren als weitere Zellkontakte neben Adhäsionsverbindungen entstanden sind, um zusätzliche Belastungen in extremeren Situationen abzufedern. Neben der Entwicklung und Experimenten mit dem Desmoplakin-Kraftsensor, wurde auch FLAMES (engl. fluorescence lifetime analysis and merge software) zur Analyse von Fluoreszenzlebensdauern und zum Zusammenführen von Daten entwickelt. Das Programm ermöglicht eine automatisierte Auswertung von Kraftsensorexperimenten, in denen FRET in verschiedenen Konstrukten mit Hilfe von FLIM bestimmt wird. Mit FLAMES können dabei die Fluoreszenzlebensdauern aus den Ankunftszeiten von Photonen innerhalb des spezifischen Signals bestimmt werden. Zudem kann auch der relative Anteil der Moleküle berechnet werden, die unter ausreichend Kraft stehen um den Kraftsensor zu öffnen, was einen neuen Weg darstellt die Daten eines Kraftsensorexperiments auszuwerten.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Desmoplakin, Tension Sensor, Mechanobiology, Mechanotransduction, Mechanosensing, FRET, FLIM, Molecular Force, Cellular Force, Force Sensor, Desmosome, Cell adhesion, Cell-Cell, Cell Contact, Adhesion Site, Keratinocytes, Skin, Biosensor, Kraftsensor, Zellkontakt, Adhäsionsverbindung
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
• Fakultäten: Fakultät für Chemie und Pharmazie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 29. April 2019
• 1. Bericht­erstatter:in: Fässler, Reinhard