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Synthese von Reagenzien zur ultrasensitiven massenspektrometrischen Quantifizierung von Proteinen und Steroiden
Synthese von Reagenzien zur ultrasensitiven massenspektrometrischen Quantifizierung von Proteinen und Steroiden
Die Forschung auf Proteinebene liefert wertvolle Erkenntnisse über zahlreiche biologische Prozesse. Nur mit Hilfe quantitativer Daten können wir die Zusammenhänge zwischen Proteom, Transkriptom und Genom besser verstehen. Die quantitative Proteomik vergleicht die Veränderungen der relativen Häufigkeiten von Proteinen in verschiedenen biologischen Proben. In komplexen Proteinmischungen erfolgt die Quantifizierung der Proteine in der Regel über chemische isobare Markierung der durch proteolytischen Verdau erzeugten Peptide. Mit dem Ziel einer zuverlässigen Proteinquantifizierung mit hoher Datenqualität wurden in dieser Arbeit neue isobare Reagenzien entwickelt. Gängige Reagenzien haben noch Verbesserungsbedarf hinsichtlich Sensitivität und Präzision. Isobare Marker bestehen aus Reagenz-Sets mit identischer chemischer Struktur, jedoch mit variierender Isotopenzusammensetzung. Diese Sets werden durch eine geschickte Verteilung stabiler Isotope zwischen Reporter und Balancer-Region erhalten, welche im Massenspektrometer gespalten werden. Die Generierung charakteristischer Reporter-Ionen ermöglicht die eindeutige Zuordnung der gemessenen Proteine zur jeweiligen Probe und somit die Untersuchung mehrerer Proben in einer einzigen Messung. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals ein Duplex Set eines neuen, als SulfOxid-Tag (SOT) bezeichneten, isobaren Markierungsreagenzes dargestellt werden und anschließend massenspektrometrisch evaluiert werden. Das aminreaktive Reagenz spaltet effizient und asymmetrisch im Massenspektrometer in einer Sulfoxidfragmentierung und dadurch bei geringerer Energie als die Peptide. Bei dieser Spaltung werden sowohl intensive Reporter-Ionen als auch Balancer-Peptid-Konjugate, sogenannte Komplementär-Ionen, gebildet. Der größte Vorteil des neuen Reagenzes ist die effiziente Generierung von Komplementär-Ionen, welche den Peptid-Verhältnis Verzerrungseffekt deutlich verringern kann, der durch Ionen-Interferenzen verursacht wird und bei anderen Reagenzien beobachtet wird. Auch für die klassische Quantifizierungsmethode über Reporter-Ionen Intensitäten ist das neue Reagenz ideal geeignet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine 13C markierte Variante (SOT2 179) des Reagenzes synthetisiert, die zur gleichzeitigen Untersuchung zweier Proben notwendig ist. Zudem konnte die ursprünglich verwendete Syntheseroute zur erstmaligen Darstellung des Reagenzes deutlich optimiert werden. Auf diesem Weg konnte schließlich auch die Variante SOT2 180, mit Isotopenmarkierung im Reporter, dargestellt werden. Zudem konnte eine gezielte Synthesestrategie für die 13C markierte Variante SOT2 179 entwickelt werden, durch welche der Verbrauch an 13C Formaldehyd enorm reduziert werden konnte. Durch späteren Einbau der 13C-Markierung, kann nun die 3,9-fache Menge an SOT2 179 hergestellt werden. Mit dem synthetisierten Reagenz-Duplex war es erstmals möglich eine tiefergehende massenspektrometrische Untersuchung des Reagenzes durchzuführen. Die Messungen legten eine Überarbeitung des Reagenzdesigns zur Reduktion der Spektrenkomplexität nahe. Auf Grund geringer Markierungseffizienz und niedriger Identifikationsrate wurden zwei vereinfachte Testmoleküle entworfen. Es muss noch untersucht werden, ob die Veränderung des Reagenzdesigns eine Verbesserung darstellt. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung neuer Derivatisierungsreagenzien zur Sensitivitätssteigerung schwer ionisierbarer Analyten. Derzeit ist eine zuverlässige Mengenbestimmung von Testosteron in der Hormondiagnostik noch eine große Herausforderung. Testosteron ist das wichtigste androgene Hormon im Menschen und beeinflusst eine Vielzahl wichtiger Funktionen wie Pubertärentwicklung, Knochendichte, Muskelmasse, Energie, kognitive Funktion und Stimmung. Insbesondere bei der Bestimmung von freiem Testosteron aus weiblichen oder pädiatrischen Serumproben wird eine spezifische Methode mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit benötigt. Um einen zuverlässigen Testosteron-Nachweis zu ermöglichen, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei neue Keton/Aldehyd-reaktive Derivatisierungsreagenzien entwickelt. Die Hydroxylamin-basierten Reagenzien tragen eine Sulfoxidgruppe, die im Massenspektrometer bei Kollision mit einem Stoßgas leicht gespalten wird. Der Einbau dieser massenspaltbaren Gruppe erleichtert die Entstehung spezifischer Produktionen im MS2 Scan, welche für die eindeutige Identifizierung des Analyten verwendet werden. Ein Reagenz trägt zudem eine permanent geladene Trimethylammonium-Gruppe zur Steigerung der Sensitivität. Zur Evaluierung der Fragmentierungseigenschaften sowie der sensitivitätssteigernden Eigenschaften wurden die neuen Reagenzien mit Testosteron umgesetzt, über HPLC aufgereinigt und massenspektrometrisch untersucht. Die Derivatisierung mit den neuen Reagenzien führte zu einer deutlichen Signalverstärkung gegenüber underivatisiertem Testosteron. Ursache des Verstärkungseffektes ist die effiziente Generierung charakteristischer Produktionen im MS/MS-Experiment. Für die Bestimmung dieses Verstärkungseffektes wurden die Nachweisgrenzen (LOD, limit of detection) der Testosteron-Addukte im Vergleich zu underivatisiertem Testosteron ermittelt. Zum Vergleich wurde auch der Verstärkungseffekt von Testosteron-Addukten anderer Derivatisierungsreagenzien bestimmt. Die Messungen zeigten, dass die neuen Sulfoxid-basierten Reagenzien keine Verbesserung in Bezug auf die Sensitivitätssteigerung gängiger Reagenzien darstellen. Infolgedessen wurden weitere massenspektrometrische Experimente durchgeführt, um zu ergründen warum andere Reagenzien einen größeren Verstärkungseffekt zeigen. Da die Sensitivität der Methode von der Selektivität der Fragmentierung sowie der Spaltungseffizienz abgängig ist wurden die verschiedenen Testosteron-Addukte hinsichtlich ihrer Fragmentierung bei verschiedenen CID- sowie HCD-Energien untersucht und verglichen. Die Spaltungseffizienz besagt wie „einfach“ die Spaltung der Addukte erfolgt. Folglich wird analysiert bei welchem Energiewert die Spaltung stattfindet. Die Selektivität der Spaltung entspricht der „Sauberkeit“ der Fragmentierung. Durch die Entstehung unspezifischer Fragmente nimmt die Sensitivität der Methode deutlich ab. Die durchgeführten Messungen zeigten keine signifikanten Unterschiede in der Spaltungseffizienz. Allerdings wurden erhebliche Unterschiede in der Selektivität der Fragmentierung festgestellt. Die HCD-Fragmentierung führte bei fast allen Addukten zur Bildung einer Vielzahl unspezifischer Fragmente, wohingegen die CID-Spaltung zu wenigen spezifischen Fragmenten führte. Die Fragmentierung der neue Sulfoxid-basierten Reagenzien führte vergleichsweise zur mehr unspezifischen Produktionen, wodurch die Sensitivität der Methode herabgesetzt wird. Des Weiteren konnten die Messungen zeigen, dass eine kleine Molekülgröße ideal für eine selektive Spaltung ist., Research at the protein level provides valuable insights into numerous biological processes. Only with the help of quantitative data we can better understand the relationships between proteome, transcriptome and genome. Quantitative proteomics compares the changes of the relative abundances of proteins in different biological samples. In complex protein mixtures, the quantification of proteins is usually performed by chemical isobaric labelling of the peptides produced by proteolytic digestion. New isobaric reagents have been developed with the aim of reliable protein quantification with high data quality. Current reagents still need to be improved in terms of sensitivity and precision. Isobaric markers consist of reagent sets with identical chemical structure but varying isotopic composition. These sets are obtained by a clever distribution of stable isotopes between the reporter and the balancer region, which are cleaved in the mass spectrometer. The generation of characteristic reporter ions enables the unambiguous assignment of the measured proteins to the respective sample and thus the analysis of several samples in a single measurement. Within this work, a duplex set of a new isobaric labeling reagent, named a sulfoxide tag (SOT), was synthesized and subsequently evaluated by mass spectrometry.The amine-reactive reagent cleaves efficiently and asymmetrically in the mass spectrometer in a sulfoxide fragmentation and thus at lower energy than the peptides. During this cleavage both intensive reporter ions and balancer-peptide conjugates, so-called complementary ions, are formed. The main advantage of the new reagent is the efficient generation of complementary ions, which can significantly reduce the peptide ratio distortion effect caused by ion interference observed with other reagents. The new reagent is also ideally suited for the classical quantification method using reporter ion intensities. In this work, a 13C-labelled variant (SOT2 179) of the reagent was synthesized, which is necessary for the simultaneous analysis of two samples. In addition, the originally used synthesis route for a first synthesis of the reagent could be significantly optimized. In this way, the variant SOT2 180, with isotope labels in the reporter, could also be synthesized. In addition, a specific synthesis strategy for the 13C-labelled variant SOT2 179 could be developed, which reduced the consumption of 13C-formaldehyde enormously. By adding the 13C label later, 3.9 times the amount of SOT2 179 can now be produced. The synthesized duplex-reagent made it possible to perform a more in-depth mass spectrometric analysis of the reagent. The measurements suggested a change of the reagent design to reduce spectral complexity. Due to a low labeling efficiency and a low identification rate, two simplified test molecules were designed. It remains to be seen whether the change in reagent design is an improvement. The second part of this thesis deals with the development of new derivatization reagents to increase the sensitivity of difficult-to-ionize analytes. At present, reliable quantitative determination of testosterone is still a major challenge in hormone diagnostics. Testosterone is the most important androgenic hormone in humans and influences a variety of important functions such as pubertal development, bone density, muscle mass, energy, cognitive function and mood. In particular, the determination of free testosterone from female or pediatric serum samples requires a specific method with high sensitivity and accuracy. In order to provide reliable testosterone detection, two new ketone/aldehyde reactive derivatization reagents were developed. The hydroxylamine-based reagents carry a sulfoxide group, which is easily cleaved in the mass spectrometer by collision induced dissociation. This mass cleavable group facilitates the development of specific product ions in the MS2 scan, which are used for the unique identification of the analyte. One reagent carried in addition a permanently charged trimethylammonium group to increase sensitivity. To evaluate the fragmentation properties and the sensitivity enhancing properties, testosterone was derivatized with the new reagents. The adduct was purified via HPLC and examined by mass spectrometry. Derivatization with the new reagents led to a significant signal amplification compared to underivatized testosterone. The amplification effect is caused by the efficient generation of characteristic product ions in the MS/MS experiment. For the determination of this amplification effect, the detection limits (LODs) of the testosterone adducts in comparison to underivatized testosterone were determined. For comparison, the amplification effect of testosterone adducts of other derivatization reagents was also determined. The measurements showed that the new sulfoxide-based reagents did not lead to an improvement compared to common reagents. As a result, further mass spectrometric experiments were conducted to investigate why other reagents showed a greater amplification effect. Since the sensitivity of the method depends on the selectivity of the fragmentation and the cleavage efficiency, the different testosterone adducts were investigated and compared with respect to their fragmentation at different CID and HCD energies. The cleavage efficiency indicates how "simple" the cleavage of the adducts is. Consequently, the energy value at which the cleavage takes place was analyzed. It was found that the selectivity of the cleavage correlates with the "cleanliness" of the fragmentation. Due to the formation of unspecific fragments, the sensitivity of the method decreases significantly. The performed measurements showed no significant differences regarding cleavage efficiency. However, significant differences in the selectivity of fragmentation were found. HCD fragmentation led to the formation of many non-specific fragments in almost all adducts, whereas CID cleavage led to only few specific fragments. Fragmentation of the new sulfoxide-based reagents generated more unspecific product ions, reducing the sensitivity of the method. Furthermore, the measurements showed that a small molecule size is ideal for selective cleavage.
Proteomics, Isobaric Labeling, Quantification, Protomik, Isobare Markierung, Quatifizierung
Wallner, Miriam
2019
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Wallner, Miriam (2019): Synthese von Reagenzien zur ultrasensitiven massenspektrometrischen Quantifizierung von Proteinen und Steroiden. Dissertation, LMU München: Faculty of Chemistry and Pharmacy
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Abstract

Die Forschung auf Proteinebene liefert wertvolle Erkenntnisse über zahlreiche biologische Prozesse. Nur mit Hilfe quantitativer Daten können wir die Zusammenhänge zwischen Proteom, Transkriptom und Genom besser verstehen. Die quantitative Proteomik vergleicht die Veränderungen der relativen Häufigkeiten von Proteinen in verschiedenen biologischen Proben. In komplexen Proteinmischungen erfolgt die Quantifizierung der Proteine in der Regel über chemische isobare Markierung der durch proteolytischen Verdau erzeugten Peptide. Mit dem Ziel einer zuverlässigen Proteinquantifizierung mit hoher Datenqualität wurden in dieser Arbeit neue isobare Reagenzien entwickelt. Gängige Reagenzien haben noch Verbesserungsbedarf hinsichtlich Sensitivität und Präzision. Isobare Marker bestehen aus Reagenz-Sets mit identischer chemischer Struktur, jedoch mit variierender Isotopenzusammensetzung. Diese Sets werden durch eine geschickte Verteilung stabiler Isotope zwischen Reporter und Balancer-Region erhalten, welche im Massenspektrometer gespalten werden. Die Generierung charakteristischer Reporter-Ionen ermöglicht die eindeutige Zuordnung der gemessenen Proteine zur jeweiligen Probe und somit die Untersuchung mehrerer Proben in einer einzigen Messung. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals ein Duplex Set eines neuen, als SulfOxid-Tag (SOT) bezeichneten, isobaren Markierungsreagenzes dargestellt werden und anschließend massenspektrometrisch evaluiert werden. Das aminreaktive Reagenz spaltet effizient und asymmetrisch im Massenspektrometer in einer Sulfoxidfragmentierung und dadurch bei geringerer Energie als die Peptide. Bei dieser Spaltung werden sowohl intensive Reporter-Ionen als auch Balancer-Peptid-Konjugate, sogenannte Komplementär-Ionen, gebildet. Der größte Vorteil des neuen Reagenzes ist die effiziente Generierung von Komplementär-Ionen, welche den Peptid-Verhältnis Verzerrungseffekt deutlich verringern kann, der durch Ionen-Interferenzen verursacht wird und bei anderen Reagenzien beobachtet wird. Auch für die klassische Quantifizierungsmethode über Reporter-Ionen Intensitäten ist das neue Reagenz ideal geeignet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine 13C markierte Variante (SOT2 179) des Reagenzes synthetisiert, die zur gleichzeitigen Untersuchung zweier Proben notwendig ist. Zudem konnte die ursprünglich verwendete Syntheseroute zur erstmaligen Darstellung des Reagenzes deutlich optimiert werden. Auf diesem Weg konnte schließlich auch die Variante SOT2 180, mit Isotopenmarkierung im Reporter, dargestellt werden. Zudem konnte eine gezielte Synthesestrategie für die 13C markierte Variante SOT2 179 entwickelt werden, durch welche der Verbrauch an 13C Formaldehyd enorm reduziert werden konnte. Durch späteren Einbau der 13C-Markierung, kann nun die 3,9-fache Menge an SOT2 179 hergestellt werden. Mit dem synthetisierten Reagenz-Duplex war es erstmals möglich eine tiefergehende massenspektrometrische Untersuchung des Reagenzes durchzuführen. Die Messungen legten eine Überarbeitung des Reagenzdesigns zur Reduktion der Spektrenkomplexität nahe. Auf Grund geringer Markierungseffizienz und niedriger Identifikationsrate wurden zwei vereinfachte Testmoleküle entworfen. Es muss noch untersucht werden, ob die Veränderung des Reagenzdesigns eine Verbesserung darstellt. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung neuer Derivatisierungsreagenzien zur Sensitivitätssteigerung schwer ionisierbarer Analyten. Derzeit ist eine zuverlässige Mengenbestimmung von Testosteron in der Hormondiagnostik noch eine große Herausforderung. Testosteron ist das wichtigste androgene Hormon im Menschen und beeinflusst eine Vielzahl wichtiger Funktionen wie Pubertärentwicklung, Knochendichte, Muskelmasse, Energie, kognitive Funktion und Stimmung. Insbesondere bei der Bestimmung von freiem Testosteron aus weiblichen oder pädiatrischen Serumproben wird eine spezifische Methode mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit benötigt. Um einen zuverlässigen Testosteron-Nachweis zu ermöglichen, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei neue Keton/Aldehyd-reaktive Derivatisierungsreagenzien entwickelt. Die Hydroxylamin-basierten Reagenzien tragen eine Sulfoxidgruppe, die im Massenspektrometer bei Kollision mit einem Stoßgas leicht gespalten wird. Der Einbau dieser massenspaltbaren Gruppe erleichtert die Entstehung spezifischer Produktionen im MS2 Scan, welche für die eindeutige Identifizierung des Analyten verwendet werden. Ein Reagenz trägt zudem eine permanent geladene Trimethylammonium-Gruppe zur Steigerung der Sensitivität. Zur Evaluierung der Fragmentierungseigenschaften sowie der sensitivitätssteigernden Eigenschaften wurden die neuen Reagenzien mit Testosteron umgesetzt, über HPLC aufgereinigt und massenspektrometrisch untersucht. Die Derivatisierung mit den neuen Reagenzien führte zu einer deutlichen Signalverstärkung gegenüber underivatisiertem Testosteron. Ursache des Verstärkungseffektes ist die effiziente Generierung charakteristischer Produktionen im MS/MS-Experiment. Für die Bestimmung dieses Verstärkungseffektes wurden die Nachweisgrenzen (LOD, limit of detection) der Testosteron-Addukte im Vergleich zu underivatisiertem Testosteron ermittelt. Zum Vergleich wurde auch der Verstärkungseffekt von Testosteron-Addukten anderer Derivatisierungsreagenzien bestimmt. Die Messungen zeigten, dass die neuen Sulfoxid-basierten Reagenzien keine Verbesserung in Bezug auf die Sensitivitätssteigerung gängiger Reagenzien darstellen. Infolgedessen wurden weitere massenspektrometrische Experimente durchgeführt, um zu ergründen warum andere Reagenzien einen größeren Verstärkungseffekt zeigen. Da die Sensitivität der Methode von der Selektivität der Fragmentierung sowie der Spaltungseffizienz abgängig ist wurden die verschiedenen Testosteron-Addukte hinsichtlich ihrer Fragmentierung bei verschiedenen CID- sowie HCD-Energien untersucht und verglichen. Die Spaltungseffizienz besagt wie „einfach“ die Spaltung der Addukte erfolgt. Folglich wird analysiert bei welchem Energiewert die Spaltung stattfindet. Die Selektivität der Spaltung entspricht der „Sauberkeit“ der Fragmentierung. Durch die Entstehung unspezifischer Fragmente nimmt die Sensitivität der Methode deutlich ab. Die durchgeführten Messungen zeigten keine signifikanten Unterschiede in der Spaltungseffizienz. Allerdings wurden erhebliche Unterschiede in der Selektivität der Fragmentierung festgestellt. Die HCD-Fragmentierung führte bei fast allen Addukten zur Bildung einer Vielzahl unspezifischer Fragmente, wohingegen die CID-Spaltung zu wenigen spezifischen Fragmenten führte. Die Fragmentierung der neue Sulfoxid-basierten Reagenzien führte vergleichsweise zur mehr unspezifischen Produktionen, wodurch die Sensitivität der Methode herabgesetzt wird. Des Weiteren konnten die Messungen zeigen, dass eine kleine Molekülgröße ideal für eine selektive Spaltung ist.

Abstract

Research at the protein level provides valuable insights into numerous biological processes. Only with the help of quantitative data we can better understand the relationships between proteome, transcriptome and genome. Quantitative proteomics compares the changes of the relative abundances of proteins in different biological samples. In complex protein mixtures, the quantification of proteins is usually performed by chemical isobaric labelling of the peptides produced by proteolytic digestion. New isobaric reagents have been developed with the aim of reliable protein quantification with high data quality. Current reagents still need to be improved in terms of sensitivity and precision. Isobaric markers consist of reagent sets with identical chemical structure but varying isotopic composition. These sets are obtained by a clever distribution of stable isotopes between the reporter and the balancer region, which are cleaved in the mass spectrometer. The generation of characteristic reporter ions enables the unambiguous assignment of the measured proteins to the respective sample and thus the analysis of several samples in a single measurement. Within this work, a duplex set of a new isobaric labeling reagent, named a sulfoxide tag (SOT), was synthesized and subsequently evaluated by mass spectrometry.The amine-reactive reagent cleaves efficiently and asymmetrically in the mass spectrometer in a sulfoxide fragmentation and thus at lower energy than the peptides. During this cleavage both intensive reporter ions and balancer-peptide conjugates, so-called complementary ions, are formed. The main advantage of the new reagent is the efficient generation of complementary ions, which can significantly reduce the peptide ratio distortion effect caused by ion interference observed with other reagents. The new reagent is also ideally suited for the classical quantification method using reporter ion intensities. In this work, a 13C-labelled variant (SOT2 179) of the reagent was synthesized, which is necessary for the simultaneous analysis of two samples. In addition, the originally used synthesis route for a first synthesis of the reagent could be significantly optimized. In this way, the variant SOT2 180, with isotope labels in the reporter, could also be synthesized. In addition, a specific synthesis strategy for the 13C-labelled variant SOT2 179 could be developed, which reduced the consumption of 13C-formaldehyde enormously. By adding the 13C label later, 3.9 times the amount of SOT2 179 can now be produced. The synthesized duplex-reagent made it possible to perform a more in-depth mass spectrometric analysis of the reagent. The measurements suggested a change of the reagent design to reduce spectral complexity. Due to a low labeling efficiency and a low identification rate, two simplified test molecules were designed. It remains to be seen whether the change in reagent design is an improvement. The second part of this thesis deals with the development of new derivatization reagents to increase the sensitivity of difficult-to-ionize analytes. At present, reliable quantitative determination of testosterone is still a major challenge in hormone diagnostics. Testosterone is the most important androgenic hormone in humans and influences a variety of important functions such as pubertal development, bone density, muscle mass, energy, cognitive function and mood. In particular, the determination of free testosterone from female or pediatric serum samples requires a specific method with high sensitivity and accuracy. In order to provide reliable testosterone detection, two new ketone/aldehyde reactive derivatization reagents were developed. The hydroxylamine-based reagents carry a sulfoxide group, which is easily cleaved in the mass spectrometer by collision induced dissociation. This mass cleavable group facilitates the development of specific product ions in the MS2 scan, which are used for the unique identification of the analyte. One reagent carried in addition a permanently charged trimethylammonium group to increase sensitivity. To evaluate the fragmentation properties and the sensitivity enhancing properties, testosterone was derivatized with the new reagents. The adduct was purified via HPLC and examined by mass spectrometry. Derivatization with the new reagents led to a significant signal amplification compared to underivatized testosterone. The amplification effect is caused by the efficient generation of characteristic product ions in the MS/MS experiment. For the determination of this amplification effect, the detection limits (LODs) of the testosterone adducts in comparison to underivatized testosterone were determined. For comparison, the amplification effect of testosterone adducts of other derivatization reagents was also determined. The measurements showed that the new sulfoxide-based reagents did not lead to an improvement compared to common reagents. As a result, further mass spectrometric experiments were conducted to investigate why other reagents showed a greater amplification effect. Since the sensitivity of the method depends on the selectivity of the fragmentation and the cleavage efficiency, the different testosterone adducts were investigated and compared with respect to their fragmentation at different CID and HCD energies. The cleavage efficiency indicates how "simple" the cleavage of the adducts is. Consequently, the energy value at which the cleavage takes place was analyzed. It was found that the selectivity of the cleavage correlates with the "cleanliness" of the fragmentation. Due to the formation of unspecific fragments, the sensitivity of the method decreases significantly. The performed measurements showed no significant differences regarding cleavage efficiency. However, significant differences in the selectivity of fragmentation were found. HCD fragmentation led to the formation of many non-specific fragments in almost all adducts, whereas CID cleavage led to only few specific fragments. Fragmentation of the new sulfoxide-based reagents generated more unspecific product ions, reducing the sensitivity of the method. Furthermore, the measurements showed that a small molecule size is ideal for selective cleavage.