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Exceptionally sweet - Studies on the bacterial arginine rhamnosyltransferase EarP
Exceptionally sweet - Studies on the bacterial arginine rhamnosyltransferase EarP
Bacterial protein glycosylation affects numerous cellular properties, including physiology and pathogenicity. The transfer of carbohydrates to a nitrogen atom is known as N glycosylation and almost exclusively occurs on asparagine side chains. In contrast, EarP represents a novel type of arginine-modifying glycosyltransferases. This enzyme uses TDP β-L-rhamnose as a donor substrate to activate the specialized translation elongation factor P (EF-P) in about 10 % of sequenced bacteria, including the clinically relevant species Pseudomonas aeruginosa and Neisseria meningitidis. The post-translational modification of EF-P is crucial for bacterial fitness and also constitutes a prerequisite for virulence. As the amido group of asparagine and the arginine guanidinium are chemically distinct, the activation of the latter might be based on a so far unsolved molecular mechanism. Consequently, the structural characterization of EarP and its products is of clinical and functional importance. In this regard, NMR analyses unambiguously identified the product of the glycosylation reaction as α-rhamnosyl-arginine. Thus, EarP inverts the anomeric configuration of rhamnose during the reaction. Anomer-specific mono-rhamnosyl-arginine-containing peptides were synthetized and used to raise antibodies against the modified side chain. These immunoglobulins were characterized with respect to their sensitivity and specificity towards the target epitope and used to determine enzyme kinetics of EarP. X-ray crystallography identified EarP as a member of the inverting GT-B superfamily and revealed the site for donor binding. Bioinformatic and mutant analyses elucidated the functional significance of several amino acids in orienting the nucleotide sugar and demonstrated the importance of two highly conserved aspartates for catalysis. Additionally, NMR titration experiments revealed that EarP mainly binds the N-terminal β barrel domain of its acceptor substrate EF-P. This information was utilized to generate the first synthetic target for EarP-mediated protein modification. The structurally but not sequentially related EF-P homologue from E. coli is naturally activated by lysylation of a lysine side chain. Successive mutation not only allowed modification but also activation of E. coli EF-P by the non-cognate and EarP-mediated rhamnosylation. This thesis provides new insights into the structure-function relationship of inverting arginine glycosylation. Additionally, it lays the groundwork for the application of EarP in synthetic biology and clinical research., Die Glykosylierung bakterieller Proteine beeinflusst zahlreiche zelluläre Eigenschaften wie Physiologie und Pathogenität. Die Übertragung von Kohlenhydraten auf ein Stickstoffatom wird als N-Glykosylierung bezeichnet und erfolgt fast ausschließlich an Asparagin-Seitenketten. Im Gegensatz dazu gehört EarP zu einer neuen Klasse von Arginin-modifizierenden Glykosyltransferasen. In etwa 10 % der sequenzierten Bakterien, einschließlich der klinisch relevanten Spezies Pseudomonas aeruginosa und Neisseria meningitidis, verwendet dieses Enzym TDP-β-L-rhamnose als Donorsubstrat zur Aktivierung des spezialisierten Translationselongationsfaktors P (EF-P). Die post-translationale Modifikation von EF-P ist von entscheidender Bedeutung für die bakterielle Fitness und eine Voraussetzung für Virulenz. Da die Amidogruppe von Asparagin und die Guanidinogruppe von Arginin chemisch unterschiedlich sind, erfolgt die Aktivierung der letzteren durch einen bisher unerforschten molekularen Mechanismus. Folglich ist die strukturelle Charakterisierung von EarP und seinen Katalyseprodukten sowohl von medizinischer als auch funktioneller Bedeutung. Mittels NMR wurde zunächst das Produkt der Glykosylierungsreaktion von EarP eindeutig als α-Rhamnosyl-Arginin identifiziert. Somit invertiert EarP die anomere Konfiguration von Rhamnose während der Reaktion. Anomer-spezifische mono-Rhamnosyl-Arginin enthaltende Peptide wurden synthetisiert und zur Generierung von Antikörpern verwendet. Diese Immunglobuline wurden hinsichtlich Sensitivität und Spezifität gegenüber dem Epitop charakterisiert und zur Bestimmung der Enzymkinetik von EarP verwendet. Die Kristallstrukturanalyse von EarP ermöglichte nicht nur eine Zuordnung des Enzyms zur Superfamilie der invertierenden GT-B-Glykosyltransferasen, sondern zeigte auch die Position der Donorbindestelle auf. Weitere bioinformatische und Mutagenese-basierte Studien führten zur Identifizierung von zwei für die Katalyse wichtigen Aspartaten sowie von mehreren Aminosäuren, die für die Orientierung des Nukleotidzuckers von Bedeutung sind. NMR-Titrationen ergaben, dass EarP hauptsächlich die N-terminale β-Barreldomäne des Akzeptorsubstrates EF-P bindet. Diese Information wurde verwendet, um den ersten synthetischen Akzeptor für eine EarP-vermittelte Proteinmodifikation zu generieren. Das strukturell, aber nicht sequentiell verwandte EF-P-Homolog von E. coli wird natürlicherweise durch Lysylierung einer Lysin-Seitenkette aktiviert. Infolge sukzessiver Aminsoäureaustausche wurde nicht nur die Modifikation von E. coli EF-P durch eine EarP vermittelte Rhamnosylierung erreicht, sondern auch die Aktivierung dieses Elongationsfaktors. Diese Arbeit liefert somit neue Erkenntnisse über die Struktur-Funktionsbeziehung der invertierenden Arginin-Glykosylierung. Darüber hinaus legt sie den Grundstein für die Anwendung von EarP in der Synthetischen Biologie und der klinischen Forschung.
N-glycosylation, arginine glycosylation, rhamnosylation, post-translational modification, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa
Krafczyk, Ralph
2018
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Krafczyk, Ralph (2018): Exceptionally sweet - Studies on the bacterial arginine rhamnosyltransferase EarP. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Bacterial protein glycosylation affects numerous cellular properties, including physiology and pathogenicity. The transfer of carbohydrates to a nitrogen atom is known as N glycosylation and almost exclusively occurs on asparagine side chains. In contrast, EarP represents a novel type of arginine-modifying glycosyltransferases. This enzyme uses TDP β-L-rhamnose as a donor substrate to activate the specialized translation elongation factor P (EF-P) in about 10 % of sequenced bacteria, including the clinically relevant species Pseudomonas aeruginosa and Neisseria meningitidis. The post-translational modification of EF-P is crucial for bacterial fitness and also constitutes a prerequisite for virulence. As the amido group of asparagine and the arginine guanidinium are chemically distinct, the activation of the latter might be based on a so far unsolved molecular mechanism. Consequently, the structural characterization of EarP and its products is of clinical and functional importance. In this regard, NMR analyses unambiguously identified the product of the glycosylation reaction as α-rhamnosyl-arginine. Thus, EarP inverts the anomeric configuration of rhamnose during the reaction. Anomer-specific mono-rhamnosyl-arginine-containing peptides were synthetized and used to raise antibodies against the modified side chain. These immunoglobulins were characterized with respect to their sensitivity and specificity towards the target epitope and used to determine enzyme kinetics of EarP. X-ray crystallography identified EarP as a member of the inverting GT-B superfamily and revealed the site for donor binding. Bioinformatic and mutant analyses elucidated the functional significance of several amino acids in orienting the nucleotide sugar and demonstrated the importance of two highly conserved aspartates for catalysis. Additionally, NMR titration experiments revealed that EarP mainly binds the N-terminal β barrel domain of its acceptor substrate EF-P. This information was utilized to generate the first synthetic target for EarP-mediated protein modification. The structurally but not sequentially related EF-P homologue from E. coli is naturally activated by lysylation of a lysine side chain. Successive mutation not only allowed modification but also activation of E. coli EF-P by the non-cognate and EarP-mediated rhamnosylation. This thesis provides new insights into the structure-function relationship of inverting arginine glycosylation. Additionally, it lays the groundwork for the application of EarP in synthetic biology and clinical research.

Abstract

Die Glykosylierung bakterieller Proteine beeinflusst zahlreiche zelluläre Eigenschaften wie Physiologie und Pathogenität. Die Übertragung von Kohlenhydraten auf ein Stickstoffatom wird als N-Glykosylierung bezeichnet und erfolgt fast ausschließlich an Asparagin-Seitenketten. Im Gegensatz dazu gehört EarP zu einer neuen Klasse von Arginin-modifizierenden Glykosyltransferasen. In etwa 10 % der sequenzierten Bakterien, einschließlich der klinisch relevanten Spezies Pseudomonas aeruginosa und Neisseria meningitidis, verwendet dieses Enzym TDP-β-L-rhamnose als Donorsubstrat zur Aktivierung des spezialisierten Translationselongationsfaktors P (EF-P). Die post-translationale Modifikation von EF-P ist von entscheidender Bedeutung für die bakterielle Fitness und eine Voraussetzung für Virulenz. Da die Amidogruppe von Asparagin und die Guanidinogruppe von Arginin chemisch unterschiedlich sind, erfolgt die Aktivierung der letzteren durch einen bisher unerforschten molekularen Mechanismus. Folglich ist die strukturelle Charakterisierung von EarP und seinen Katalyseprodukten sowohl von medizinischer als auch funktioneller Bedeutung. Mittels NMR wurde zunächst das Produkt der Glykosylierungsreaktion von EarP eindeutig als α-Rhamnosyl-Arginin identifiziert. Somit invertiert EarP die anomere Konfiguration von Rhamnose während der Reaktion. Anomer-spezifische mono-Rhamnosyl-Arginin enthaltende Peptide wurden synthetisiert und zur Generierung von Antikörpern verwendet. Diese Immunglobuline wurden hinsichtlich Sensitivität und Spezifität gegenüber dem Epitop charakterisiert und zur Bestimmung der Enzymkinetik von EarP verwendet. Die Kristallstrukturanalyse von EarP ermöglichte nicht nur eine Zuordnung des Enzyms zur Superfamilie der invertierenden GT-B-Glykosyltransferasen, sondern zeigte auch die Position der Donorbindestelle auf. Weitere bioinformatische und Mutagenese-basierte Studien führten zur Identifizierung von zwei für die Katalyse wichtigen Aspartaten sowie von mehreren Aminosäuren, die für die Orientierung des Nukleotidzuckers von Bedeutung sind. NMR-Titrationen ergaben, dass EarP hauptsächlich die N-terminale β-Barreldomäne des Akzeptorsubstrates EF-P bindet. Diese Information wurde verwendet, um den ersten synthetischen Akzeptor für eine EarP-vermittelte Proteinmodifikation zu generieren. Das strukturell, aber nicht sequentiell verwandte EF-P-Homolog von E. coli wird natürlicherweise durch Lysylierung einer Lysin-Seitenkette aktiviert. Infolge sukzessiver Aminsoäureaustausche wurde nicht nur die Modifikation von E. coli EF-P durch eine EarP vermittelte Rhamnosylierung erreicht, sondern auch die Aktivierung dieses Elongationsfaktors. Diese Arbeit liefert somit neue Erkenntnisse über die Struktur-Funktionsbeziehung der invertierenden Arginin-Glykosylierung. Darüber hinaus legt sie den Grundstein für die Anwendung von EarP in der Synthetischen Biologie und der klinischen Forschung.