Logo Logo
Help
Contact
Switch language to German
Mechanics of pathogen adhesion
Mechanics of pathogen adhesion
Proteins that anchor cells to their targets have evolved considerable resilience to mechanical forces. Using atomic force microscopy-based single molecule force spectroscopy the present thesis establishes some of the highest mechanostabilities in protein receptor-ligand dissociation and protein unfolding to date. By combining molecular dynamics simulations in silico, and force spectroscopy in vitro the molecular mechanisms that govern these extreme mechanics were deconstructed. Pathogenic, gram-positive bacteria employ an arsenal of cell wall anchored proteins that adhere to their human hosts. The prototypical adhesin SdrG from S. epidermidis binds a short peptide sequence from fibrinogen β.The forces withstood by this interaction and its homologues from S. aureus are in the range of 2 nN, an exceptional mechanical stability that rivals the strength of a covalent bond. In the mechanism underlying these extreme forces, the pathogen adhesin establishes backbone-backbone hydrogen bonds with the peptide into a very specific shear geometry. When force is applied, all of these hydrogen bonds must be broken collectively, as the peptide is tightly confined by the adhesin. Considering the mechanism mainly relies on backbone hydrogen bonds, these adhesins can attach to their target with exceptionally resilient mechanostability - hence virtually independent of peptide side chains and thus sequence. Along their stalks, some of these pathogen adhesins contain so called B domains. These domains propagate the mechanical force from the ultrastable ligand binding region to the bacterium. B domains unfold in the range of 2 nN, making them the mechanically strongest protein fold to date by a large margin. B domains coordinate three calcium ions, which govern their stability. Calcium chelation reduces B domain unfolding forces by a factor of four. Through incapacitating calcium coordination sites, monitoring folding under calcium titration, and parallelized force spectroscopy, the contribution of each calcium to the extraordinary mechanical strength of these domains could be mapped. The interaction between cohesins and dockerins assembles the cellulosome, an extracellular network of enzymes that breaks down cellulose. Cellulosomes have attracted considerable attention, both in the context of efficient breakdown of lignocellulose and as a robust scaffold to assemble programmable enzyme arrangements. The mechanical stabilities of cohesins binding dockerins are varied. Here, it is established that they can range from around 60 pN in Clostridium perfringens, to over 600 pN in Ruminococcus flavefaciens. In sum, the mechanisms deciphered here in part explain the persistence of gram-positive pathogens invading their hosts and could be used as inspiration to weaken or even block their adhesion to hosts. Ultimately the principles behind such mechanisms may serve as blueprints to adapt, engineer and potentially even design functional proteins with extreme mechanical properties., Proteine, die Zellen an ihre Bindepartner verankern, haben zum Teil beachtliche Widerstandsfähigkeit gegenüber mechanischen Kräften entwickelt. Diese Arbeit etabliert mit Rasterkraftmikroskopie basierter Einzelmolekülkraftspektroskopie die höchsten bekannten mechanischen Stabilitäten von Protein Rezeptor-Ligand Interaktionen und von Proteinfaltungen. Durch die Kombination von Molekulardynamiksimulationen in silico und Einzelmolekülkraftspektroskopie in vitro konnte der molekulare Mechanismus, der diesen extremen Stärken zu Grunde liegt, aufgeklärt werden. Pathogene gram-positive Bakterien nutzen ein Arsenal von Proteinen, die an ihrer Zellwand verankert sind, um sich an ihre menschlichen Wirte anzulagern. Das prototypische Adhesin SdrG aus S. epidermidis bindet hierzu eine kurze Peptidsequenz der β-Kette von Fibrinogen. Diese Interaktion, sowie ihre Homologe aus S. aureus, kann Kräften im Bereich von 2 nN standhalten. Diese außergewöhnlichen Kräfte bewegen sich nahe der mechanischen Stabilität einer kovalenten Bindung. Der Mechanismus, der diese extremen Kräfte ermöglicht, basiert auf Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Adhesin und seinem Zielpeptid. Diese Bindungen müssen kollektiv, zur exakt gleichen Zeit in einer Schergeometrie gebrochen werden, da das Adhesin das Peptid von allen Seiten einengt. Der Mechanismus basiert hauptsächlich auf Bindungen an das Peptidrückgrat. Dementsprechend können pathogene Bakterien extrem hohe Mechanostabilitäten erreichen, weitestgehend unabhängig von den Seitenketten - ergo der Sequenz - des Zielpeptids. Bestimmte pathogene Adhesine besitzen entlang ihrer Stämme sogenannte B Domänen. Diese leiten die mechanischen Kräfte von der ultrastabilen wirtsbindenden Region an das Bakterium. B Domänen entfalten bei Kräften im Bereich von 2 nN, was sie zu den mit Abstand mechanisch stärksten Proteinfaltungen macht. B Domänen binden drei Calciumionen koordinativ. Diese verleihen ihnen ihre hohe Stabilität. Chelation dieser Ionen reduziert die Entfaltungskräfte einer B Domäne auf ein Viertel. Durch systematisches Ausschalten der Calciumkoordinationsstellen, parallelisierter Kraftspektroskopie und Bestimmung der Rückfaltungswahrscheinlichkeiten unter Titration von Calcium konnte der Beitrag jedes Ions zu der insgesamt außerordentlichen Stabilität der B Domänen kartographiert werden. Die Interaktionen zwischen Cohesinen und Dockerinen formt das Cellulosom, ein extrazelluläres Enzymnetzwerk das Cellulose metabolisiert. Celluosome sind von großem Interesse: sowohl aufgrund ihrer potentiellen Anwendungen zum Abbau von Lignozellulose für Biokraftstoffe, als auch um sie zu einem robusten molekularen Steckbrett für Enzymkaskaden umzuprogrammieren. Die mechanische Stabilitäten verschiedener Cohesin-Dockerin Bindungen variieren stark. In dieser Arbeit wurden Kräfte von 60 pN in Clostridium perfringens bis zu über 600 pN in Ruminococcus flavefaciens ermittelt. Die hier entschlüsselten Mechanismen bakterieller Adhäsion erklären zum Teil die Hartnäckigkeit mit der gram-positive Krankheitserreger ihre Wirte infizieren. Sie können potentiell verwendet werden, um die Bindung an Wirte zu schwächen oder sogar zu blockieren. In letzter Konsequenz können die hier aufgeklärten Mechanismen als Skizzen zur Modifikation, Adaption und potentiell dem Design funktionaler Proteine mit extremen mechanischen Eigenschaften dienen.
Not available
Milles, Lukas
2018
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Milles, Lukas (2018): Mechanics of pathogen adhesion. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
[img]
Preview
PDF
Milles_Lukas.pdf

111MB

Abstract

Proteins that anchor cells to their targets have evolved considerable resilience to mechanical forces. Using atomic force microscopy-based single molecule force spectroscopy the present thesis establishes some of the highest mechanostabilities in protein receptor-ligand dissociation and protein unfolding to date. By combining molecular dynamics simulations in silico, and force spectroscopy in vitro the molecular mechanisms that govern these extreme mechanics were deconstructed. Pathogenic, gram-positive bacteria employ an arsenal of cell wall anchored proteins that adhere to their human hosts. The prototypical adhesin SdrG from S. epidermidis binds a short peptide sequence from fibrinogen β.The forces withstood by this interaction and its homologues from S. aureus are in the range of 2 nN, an exceptional mechanical stability that rivals the strength of a covalent bond. In the mechanism underlying these extreme forces, the pathogen adhesin establishes backbone-backbone hydrogen bonds with the peptide into a very specific shear geometry. When force is applied, all of these hydrogen bonds must be broken collectively, as the peptide is tightly confined by the adhesin. Considering the mechanism mainly relies on backbone hydrogen bonds, these adhesins can attach to their target with exceptionally resilient mechanostability - hence virtually independent of peptide side chains and thus sequence. Along their stalks, some of these pathogen adhesins contain so called B domains. These domains propagate the mechanical force from the ultrastable ligand binding region to the bacterium. B domains unfold in the range of 2 nN, making them the mechanically strongest protein fold to date by a large margin. B domains coordinate three calcium ions, which govern their stability. Calcium chelation reduces B domain unfolding forces by a factor of four. Through incapacitating calcium coordination sites, monitoring folding under calcium titration, and parallelized force spectroscopy, the contribution of each calcium to the extraordinary mechanical strength of these domains could be mapped. The interaction between cohesins and dockerins assembles the cellulosome, an extracellular network of enzymes that breaks down cellulose. Cellulosomes have attracted considerable attention, both in the context of efficient breakdown of lignocellulose and as a robust scaffold to assemble programmable enzyme arrangements. The mechanical stabilities of cohesins binding dockerins are varied. Here, it is established that they can range from around 60 pN in Clostridium perfringens, to over 600 pN in Ruminococcus flavefaciens. In sum, the mechanisms deciphered here in part explain the persistence of gram-positive pathogens invading their hosts and could be used as inspiration to weaken or even block their adhesion to hosts. Ultimately the principles behind such mechanisms may serve as blueprints to adapt, engineer and potentially even design functional proteins with extreme mechanical properties.

Abstract

Proteine, die Zellen an ihre Bindepartner verankern, haben zum Teil beachtliche Widerstandsfähigkeit gegenüber mechanischen Kräften entwickelt. Diese Arbeit etabliert mit Rasterkraftmikroskopie basierter Einzelmolekülkraftspektroskopie die höchsten bekannten mechanischen Stabilitäten von Protein Rezeptor-Ligand Interaktionen und von Proteinfaltungen. Durch die Kombination von Molekulardynamiksimulationen in silico und Einzelmolekülkraftspektroskopie in vitro konnte der molekulare Mechanismus, der diesen extremen Stärken zu Grunde liegt, aufgeklärt werden. Pathogene gram-positive Bakterien nutzen ein Arsenal von Proteinen, die an ihrer Zellwand verankert sind, um sich an ihre menschlichen Wirte anzulagern. Das prototypische Adhesin SdrG aus S. epidermidis bindet hierzu eine kurze Peptidsequenz der β-Kette von Fibrinogen. Diese Interaktion, sowie ihre Homologe aus S. aureus, kann Kräften im Bereich von 2 nN standhalten. Diese außergewöhnlichen Kräfte bewegen sich nahe der mechanischen Stabilität einer kovalenten Bindung. Der Mechanismus, der diese extremen Kräfte ermöglicht, basiert auf Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Adhesin und seinem Zielpeptid. Diese Bindungen müssen kollektiv, zur exakt gleichen Zeit in einer Schergeometrie gebrochen werden, da das Adhesin das Peptid von allen Seiten einengt. Der Mechanismus basiert hauptsächlich auf Bindungen an das Peptidrückgrat. Dementsprechend können pathogene Bakterien extrem hohe Mechanostabilitäten erreichen, weitestgehend unabhängig von den Seitenketten - ergo der Sequenz - des Zielpeptids. Bestimmte pathogene Adhesine besitzen entlang ihrer Stämme sogenannte B Domänen. Diese leiten die mechanischen Kräfte von der ultrastabilen wirtsbindenden Region an das Bakterium. B Domänen entfalten bei Kräften im Bereich von 2 nN, was sie zu den mit Abstand mechanisch stärksten Proteinfaltungen macht. B Domänen binden drei Calciumionen koordinativ. Diese verleihen ihnen ihre hohe Stabilität. Chelation dieser Ionen reduziert die Entfaltungskräfte einer B Domäne auf ein Viertel. Durch systematisches Ausschalten der Calciumkoordinationsstellen, parallelisierter Kraftspektroskopie und Bestimmung der Rückfaltungswahrscheinlichkeiten unter Titration von Calcium konnte der Beitrag jedes Ions zu der insgesamt außerordentlichen Stabilität der B Domänen kartographiert werden. Die Interaktionen zwischen Cohesinen und Dockerinen formt das Cellulosom, ein extrazelluläres Enzymnetzwerk das Cellulose metabolisiert. Celluosome sind von großem Interesse: sowohl aufgrund ihrer potentiellen Anwendungen zum Abbau von Lignozellulose für Biokraftstoffe, als auch um sie zu einem robusten molekularen Steckbrett für Enzymkaskaden umzuprogrammieren. Die mechanische Stabilitäten verschiedener Cohesin-Dockerin Bindungen variieren stark. In dieser Arbeit wurden Kräfte von 60 pN in Clostridium perfringens bis zu über 600 pN in Ruminococcus flavefaciens ermittelt. Die hier entschlüsselten Mechanismen bakterieller Adhäsion erklären zum Teil die Hartnäckigkeit mit der gram-positive Krankheitserreger ihre Wirte infizieren. Sie können potentiell verwendet werden, um die Bindung an Wirte zu schwächen oder sogar zu blockieren. In letzter Konsequenz können die hier aufgeklärten Mechanismen als Skizzen zur Modifikation, Adaption und potentiell dem Design funktionaler Proteine mit extremen mechanischen Eigenschaften dienen.