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Photolithographic micro-structuring of artifcial 3-dimensional hydrogel environments for cell migration studies
Photolithographic micro-structuring of artifcial 3-dimensional hydrogel environments for cell migration studies
The extracellular matrix (ECM) of cells in vivo is a complex mixture of biopolymers that form a network of varying stiffness and mesh sizes, containing soluble and matrix bound signaling molecules. Due to this complexity, it is not fully understood which cues guide cell migration in such networks. To facilitate the analysis of chemotactic or durotactic migration mechanisms, artificial ECM mimics, whose properties and composition can be fine-tuned, are needed. In this thesis photo-polymerizable, synthetic hydrogel micro-structures were developed to mimic a minimal ECM for cell migration studies. 4-armed polyethylene glycol (PEG) monomers were cross-linked with either linear PEG molecules, which results in a non-degradable network, or with a peptide cross-linker which can be cleaved by matrix-metalloproteinases (MMPs) and allows the proteolytic cell migration within the gel. Addition of a small RGD-containing peptide sequence mediates cell adhesion to the otherwise bioinert PEG network. The biocompatible polymerization induced by short illumination with UV light permits the direct encapsulation of living cells and the micro-structuring of small gel strips inside channel systems using photo-lithography. To carefully characterize the hydrogel system and its swelling properties, particle image velocimetry (PIV) was used. The obtained displacement fields show an anisotropic swelling of the gel due to the confinement in a channel. In the longitudinal middle section, the thin strips swell only in the direction of the strip width. The magnitude of the inherent gel swelling can be tuned by changing the solvent and swelling media, the type and amount of cross-linker used for the polymerization, as well as the dimensions of the channel and strip. To study how cells perceive and react to affine deformations in their surroundings, a micro-structured artificial hydrogel was used to form a strained, degradable matrix. The aforementioned anisotropic swelling uniaxially strained the gel strips. Analysis of HT-1080 cell migration in such structures showed a preferred migration parallel to the swelling direction, with a maximal alignment at intermediate strain levels. To understand the relationship between cell migration directionality and strain, a theoretical model was implemented within the framework of a collaboration. With the simulation of a proteolytic, durotactic cell movement on a 2D lattice, the same non-monotonic response to uniaxial strain as seen in the experiments was obtained. Stiffness analysis within the model showed an anisotropic stiffening of the matrix upon strain, which leads to the anisotropic cell migration. The unraveling of this fundamental mechanism as cell guidance cue in strained networks of macroscopically linear elastic materials demonstrates that strain stiffening on the microscopic scale is crucial for the cell behavior. The inherent swelling of the gel micro-structures was furthermore used to create pressurized hydrogel-hydrogel interfaces, so called sponge clamps, to establish an assay for analyzing non-proteolytic cell migration into predefined clefts. The swelling of parallel hydrogel strips fills the space in between the structures and thereby generates pressurized clefts inside a passivated channel system. By varying the gap size as well as the gel composition, the gel compression in the system can be tuned, which influences the invasion efficiency of cancer cells. Initial strip distance, but also matrix stiffness are key regulators of cell migration in the clefts. The results of this thesis illustrate how photo-structurable artificial ECM mimics and their inherent swelling enable the generation of advanced 3D migration assays to unravel fundamental guidance cues in proteolytic and non-proteolytic cancer cell migration., Die extrazelluläre Matrix (ECM) der Zellen in vivo besteht aus einer komplizierten Biopolymermischung, die Netzwerke mit unterschiedlicher Steifigkeit und Maschenweite bildet und Signalmoleküle in gelöster sowie matrixgebundener Form enthält. Aufgrund dieser Komplexität ist noch nicht vollständig verstanden welche Faktoren die Zellmigration in solchen Netzwerken beeinflussen. Um die Untersuchung von chemotaktischen und durotaktischen Migrationsmechanismen zu erleichtern werden künstliche ECM Nachbildungen, deren Eigenschaften und Zusammensetzung genau bestimmt werden können, benötigt. In dieser Doktorarbeit wurden photo-polymerisierbare, synthetische Hydrogelmikrostrukturen entwickelt um eine auf die wesentlichen Bestandteile reduziete ECM nachzubilden. Vierarmige Polyethylenglykol (PEG) Monomere wurden entweder mit linearen PEG Molekülen vernetzt, wodurch nicht-migrierbare Netwerke entstehen, oder mit einem Vernetzer bestehend aus einem Peptid, welches durch Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) gespalten werden kann und so die proteolytische Zellmigration in dem Gel ermöglicht. Der Zusatz eines kleinen Peptids, welches eine RGD-Sequenze enthält, vermittelt die Zelladhäsion an das ansonsten bioinerte PEG Netzwerk. Die biokompatible Polymerisation, welche durch kurze Belichtung mit UV Licht induziert wird, erlaubt den Einschluss von lebenden Zellen in das Gel. Durch Photolithographie können außerdem kleine Gelstrukturen in Kanalsystemen hergestellt werden. Um das Hydrogelsystem und seine Quelleigenschaften genau zu charakterisieren wurden ”Particle Image Velocimetry”(PIV) Analysen durchgeführt. Die Deformationsfelder zeigen ein anisotropes Quellen des Gels aufgrund der Begrenzung in einem Kanal. Im mittleren Bereich der Struktur quillt der dünne Streifen nur in Richtung der Streifenbreite. Durch Veränderung des Lösungsmittels und Quellmediums, der Art und Menge des verwendeten Vernetzers, sowie der Kanalhöhe und anfänglichen Streifenbreite, kann die Stärke des natürlichen Quellens beeinflusst werden. Um zu untersuchen wie Zellen affine Deformationen in ihrer Umgebung wahrnehmen und darauf reagieren, wurden mikrostrukturierte, künstliche Hydrogele genutzt um gedehnte, zersetzbare Netzwerke herzustellen. Das zuvor erwähnte anisotrope Quellen führt zu einem monoaxial gedehnten Hydrogelstreifen. Die Untersuchung der Zellmigration von HT-1080 Zellen in solchen Strukturen zeigt eine bevorzugte Migration entlang der Quellrichtung. Fuür mittlere Dehnungsstärken ist diese Ausrichtung maximal. Um den Zusammenhang zwischen der Migrationsrichtung und der Dehnung zu verstehen wurde im Rahmen einer Kooperation ein theoretisches Model realisiert. Die Simulation einer proteolytischen, durotaktischen Zellmigration auf einem 2D Gitter ergab die selbe nicht-monotone Reaktion auf die monoaxialen Dehnung, die auch in den Experimenten beobachtet wurde. Untersuchungen der Steifigkeit innerhalb des Modells zeigten eine anisotrope Versteifung der Matrix unter Dehnung, was der Grund für das anisotrope Zellverhalten ist. Durch offenlegen dieses grundlegenden Mechanismus der Zellorientierung in gedehnten, makroskopisch linear elastischen Netzwerken, wurde gezeigt, dass die Dehnungsversteifung auf der mikroskopischen Ebene entscheidend für das Zellverhalten ist. Das natürliche Quellen der Mikrostrukturen wurde desweiteren dafür genutzt unter Druck stehende Hydrogel-Hydrogel Grenzflächen, sogenannte “sponge clamps“, herzustellen, um ein System zu etablieren mit dem Proteolyse-unabhängige Zellmigration in vordefinierten Spalten untersucht werden kann. Das Quellen paralleler Streifen füllt den Raum zwischen den Strukturen und bildet dadurch einen unter Druck stehenden Spalt in einem passivierten Kanalsystem. Durch Veränderung des Abstands zwischen den Streifen und der verwendeten Gelzusammensetzung kann die Gelkompression in dem System eingestellt werden. Dadurch wird die Eindringeffizienz der Krebszellen beeinflusst. Der anfängliche Streifenabstand, aber auch die Matrixsteifigkeit sind entscheidende Regulatoren für die Zellmigration in den Spalten. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit zeigen, wie photostrukturierbare artifizielle ECMs und ihr natürliches Quellverhalten dazu genutzt werden können, fortschrittliche 3D Systeme zur Migrationsanalyse herzustellen um grundlegende Einflussfaktoren in der proteolytischen und nicht-proteolytischen Tumorzellmigration aufzudecken.
cell migration, photo-patterning, hydrogel, deformation
Balles, Miriam
2018
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Balles, Miriam (2018): Photolithographic micro-structuring of artifcial 3-dimensional hydrogel environments for cell migration studies. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
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Abstract

The extracellular matrix (ECM) of cells in vivo is a complex mixture of biopolymers that form a network of varying stiffness and mesh sizes, containing soluble and matrix bound signaling molecules. Due to this complexity, it is not fully understood which cues guide cell migration in such networks. To facilitate the analysis of chemotactic or durotactic migration mechanisms, artificial ECM mimics, whose properties and composition can be fine-tuned, are needed. In this thesis photo-polymerizable, synthetic hydrogel micro-structures were developed to mimic a minimal ECM for cell migration studies. 4-armed polyethylene glycol (PEG) monomers were cross-linked with either linear PEG molecules, which results in a non-degradable network, or with a peptide cross-linker which can be cleaved by matrix-metalloproteinases (MMPs) and allows the proteolytic cell migration within the gel. Addition of a small RGD-containing peptide sequence mediates cell adhesion to the otherwise bioinert PEG network. The biocompatible polymerization induced by short illumination with UV light permits the direct encapsulation of living cells and the micro-structuring of small gel strips inside channel systems using photo-lithography. To carefully characterize the hydrogel system and its swelling properties, particle image velocimetry (PIV) was used. The obtained displacement fields show an anisotropic swelling of the gel due to the confinement in a channel. In the longitudinal middle section, the thin strips swell only in the direction of the strip width. The magnitude of the inherent gel swelling can be tuned by changing the solvent and swelling media, the type and amount of cross-linker used for the polymerization, as well as the dimensions of the channel and strip. To study how cells perceive and react to affine deformations in their surroundings, a micro-structured artificial hydrogel was used to form a strained, degradable matrix. The aforementioned anisotropic swelling uniaxially strained the gel strips. Analysis of HT-1080 cell migration in such structures showed a preferred migration parallel to the swelling direction, with a maximal alignment at intermediate strain levels. To understand the relationship between cell migration directionality and strain, a theoretical model was implemented within the framework of a collaboration. With the simulation of a proteolytic, durotactic cell movement on a 2D lattice, the same non-monotonic response to uniaxial strain as seen in the experiments was obtained. Stiffness analysis within the model showed an anisotropic stiffening of the matrix upon strain, which leads to the anisotropic cell migration. The unraveling of this fundamental mechanism as cell guidance cue in strained networks of macroscopically linear elastic materials demonstrates that strain stiffening on the microscopic scale is crucial for the cell behavior. The inherent swelling of the gel micro-structures was furthermore used to create pressurized hydrogel-hydrogel interfaces, so called sponge clamps, to establish an assay for analyzing non-proteolytic cell migration into predefined clefts. The swelling of parallel hydrogel strips fills the space in between the structures and thereby generates pressurized clefts inside a passivated channel system. By varying the gap size as well as the gel composition, the gel compression in the system can be tuned, which influences the invasion efficiency of cancer cells. Initial strip distance, but also matrix stiffness are key regulators of cell migration in the clefts. The results of this thesis illustrate how photo-structurable artificial ECM mimics and their inherent swelling enable the generation of advanced 3D migration assays to unravel fundamental guidance cues in proteolytic and non-proteolytic cancer cell migration.

Abstract

Die extrazelluläre Matrix (ECM) der Zellen in vivo besteht aus einer komplizierten Biopolymermischung, die Netzwerke mit unterschiedlicher Steifigkeit und Maschenweite bildet und Signalmoleküle in gelöster sowie matrixgebundener Form enthält. Aufgrund dieser Komplexität ist noch nicht vollständig verstanden welche Faktoren die Zellmigration in solchen Netzwerken beeinflussen. Um die Untersuchung von chemotaktischen und durotaktischen Migrationsmechanismen zu erleichtern werden künstliche ECM Nachbildungen, deren Eigenschaften und Zusammensetzung genau bestimmt werden können, benötigt. In dieser Doktorarbeit wurden photo-polymerisierbare, synthetische Hydrogelmikrostrukturen entwickelt um eine auf die wesentlichen Bestandteile reduziete ECM nachzubilden. Vierarmige Polyethylenglykol (PEG) Monomere wurden entweder mit linearen PEG Molekülen vernetzt, wodurch nicht-migrierbare Netwerke entstehen, oder mit einem Vernetzer bestehend aus einem Peptid, welches durch Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) gespalten werden kann und so die proteolytische Zellmigration in dem Gel ermöglicht. Der Zusatz eines kleinen Peptids, welches eine RGD-Sequenze enthält, vermittelt die Zelladhäsion an das ansonsten bioinerte PEG Netzwerk. Die biokompatible Polymerisation, welche durch kurze Belichtung mit UV Licht induziert wird, erlaubt den Einschluss von lebenden Zellen in das Gel. Durch Photolithographie können außerdem kleine Gelstrukturen in Kanalsystemen hergestellt werden. Um das Hydrogelsystem und seine Quelleigenschaften genau zu charakterisieren wurden ”Particle Image Velocimetry”(PIV) Analysen durchgeführt. Die Deformationsfelder zeigen ein anisotropes Quellen des Gels aufgrund der Begrenzung in einem Kanal. Im mittleren Bereich der Struktur quillt der dünne Streifen nur in Richtung der Streifenbreite. Durch Veränderung des Lösungsmittels und Quellmediums, der Art und Menge des verwendeten Vernetzers, sowie der Kanalhöhe und anfänglichen Streifenbreite, kann die Stärke des natürlichen Quellens beeinflusst werden. Um zu untersuchen wie Zellen affine Deformationen in ihrer Umgebung wahrnehmen und darauf reagieren, wurden mikrostrukturierte, künstliche Hydrogele genutzt um gedehnte, zersetzbare Netzwerke herzustellen. Das zuvor erwähnte anisotrope Quellen führt zu einem monoaxial gedehnten Hydrogelstreifen. Die Untersuchung der Zellmigration von HT-1080 Zellen in solchen Strukturen zeigt eine bevorzugte Migration entlang der Quellrichtung. Fuür mittlere Dehnungsstärken ist diese Ausrichtung maximal. Um den Zusammenhang zwischen der Migrationsrichtung und der Dehnung zu verstehen wurde im Rahmen einer Kooperation ein theoretisches Model realisiert. Die Simulation einer proteolytischen, durotaktischen Zellmigration auf einem 2D Gitter ergab die selbe nicht-monotone Reaktion auf die monoaxialen Dehnung, die auch in den Experimenten beobachtet wurde. Untersuchungen der Steifigkeit innerhalb des Modells zeigten eine anisotrope Versteifung der Matrix unter Dehnung, was der Grund für das anisotrope Zellverhalten ist. Durch offenlegen dieses grundlegenden Mechanismus der Zellorientierung in gedehnten, makroskopisch linear elastischen Netzwerken, wurde gezeigt, dass die Dehnungsversteifung auf der mikroskopischen Ebene entscheidend für das Zellverhalten ist. Das natürliche Quellen der Mikrostrukturen wurde desweiteren dafür genutzt unter Druck stehende Hydrogel-Hydrogel Grenzflächen, sogenannte “sponge clamps“, herzustellen, um ein System zu etablieren mit dem Proteolyse-unabhängige Zellmigration in vordefinierten Spalten untersucht werden kann. Das Quellen paralleler Streifen füllt den Raum zwischen den Strukturen und bildet dadurch einen unter Druck stehenden Spalt in einem passivierten Kanalsystem. Durch Veränderung des Abstands zwischen den Streifen und der verwendeten Gelzusammensetzung kann die Gelkompression in dem System eingestellt werden. Dadurch wird die Eindringeffizienz der Krebszellen beeinflusst. Der anfängliche Streifenabstand, aber auch die Matrixsteifigkeit sind entscheidende Regulatoren für die Zellmigration in den Spalten. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit zeigen, wie photostrukturierbare artifizielle ECMs und ihr natürliches Quellverhalten dazu genutzt werden können, fortschrittliche 3D Systeme zur Migrationsanalyse herzustellen um grundlegende Einflussfaktoren in der proteolytischen und nicht-proteolytischen Tumorzellmigration aufzudecken.