Prebiotic DNA replication and analyzing a genetic disorder with thermophoresis

Edeleva, Evgeniia (2018): Prebiotic DNA replication and analyzing a genetic disorder with thermophoresis. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik

Abstract

The work presented in this Thesis is divided into three independent parts. Parts I and III are connected by the topic of the Origin of Life. Parts II and III are based on the same biophysical analysis method of microscale thermophoresis (MST). Part I focuses on prebiotic replication of DNA. Different approaches to replicate RNA and DNA under prebiotic conditions are discussed in the introduction. A nonenzymatic DNA replication system is presented as an approaches to a prebiotic replicator. Two DNA strands of 24 bases cross catalyze each other's synthesis from four 12 bases long substrate strands, two of which are in situ activated by a condensing agent 1-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimide (EDC). DNA amplified (2.2~\pm~0.5)-fold in 6 hours. Stronger amplification is suppressed by EDC-dependent modification of substrate strands. Detailed kinetic modeling was realized with the system of ordinary differential equations and allowed to understand critical parameters of the reaction. Further research should be focused on finding ways to recycle substrate or to reduce its modification. This could lead to DNA replication and elongation experiments starting from short random DNA strands. Such experiments could be analyzed with next-generation sequencing due to the formation of the natural phosphodiester bonds at the ligation sites. In part II, MST is used to develop a diagnostic assay for α1-antitriypsin (AAT) deficiency disorder working directly in blood plasma. In AAT deficiency, individuals have reduced plasma concentration of AAT, which makes them susceptible to lung emphysema among other symptoms. Surprisingly, concentration of AAT does not correlate with the severity of the symptoms manifestation. In a standard MST approach, the amplitude of the obtained binding curve is not important for the affinity analysis. In an MST-based competition assay introduced in this work, the amplitude of the obtained binding curve is sensitive to both the affinity of AAT binding to its target and the concentration of AAT in plasma. In a proof-of-principle experiment, blood plasma of individuals with AAT deficiency was used to quantify the amplitude. The amplitude showed a better correlation to the severity of the disease status than the concentration of AAT alone, suggesting that AAT affinity to its target is different in different individuals. Direct measurement of AAT affinity to its target in plasma of individuals with strong vs weak manifestation of symptoms showed that affinity was higher in individuals who were only mildly affected. This suggests that plasma composition has an effect on AAT affinity. In part III, experimental systems are developed in order to test the stereochemical theory of the origin of the genetic code. The genetic code defines the assignment of 20 amino acids to their codons. The hypotheses to what determined the assignment have been widely discussed in literature but the question remains one of the experimentally most challenging in the origin of life field. The stereochemical theory states that amino acids have an intrinsic binding affinity towards their cognate codons. This can be tested by directly measuring the interaction between the activated amino acids and RNA structures containing codons. RNA structures were developed based on literature research, and the affinity was measured with the MST method. Proof-of-principle experiments for three RNA structures were performed, and the outline for future work is detailed in the end.

Abstract

Die Arbeit, die in dieser Dissertation vorgestellt wird, besteht aus drei unabhängige Teilen. Die Teile I und III sind durch das Thema des Ursprungs des Lebens verbunden. Die Teile II und III basieren auf der gleichen biophysikalischen Analysemethode der Mikrothermophorese (MST). Teil I konzentriert sich auf die präbiotische Replikation von DNA. Verschiedene Ansätze zur Replikation von RNA und DNA unter präbiotischen Bedingungen werden in der Einführung diskutiert. Ein nonenzymatisches DNA-Replikationssystem wird als einer der möglichen Ansätze für einen präbiotischen Replikator vorgestellt. Zwei DNA-Stränge mit 24 Basen kreuz-katalysieren die gegenseitige Synthese aus vier 12 Basen langen Substratsträngen, von denen zwei in situ durch ein Kondensationsmittel 1-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimid (EDC) aktiviert werden. Eine (2.2~\pm~0.5)-fache Amplifikation wird in 6 Stunden erreicht. Eine stärkere Amplifikation wird durch EDC-induzierte Modifikation von Substratsträngen unterdrückt. Ein detailliertes kinetisches Model, das die Modifikationskinetik berücksichtigt, wurde mit einem System von gewöhnlichen Differentialgleichungen realisiert und erlaubte es, kritische Parameter der Reaktion zu verstehen. Weitere Forschungsarbeiten sollten sich darauf konzentrieren, Wege zu finden, wie das Substrat wiederverwendet werden kann oder wie seine Modifikation reduziert werden kann. Dies könnte zu DNA-Replikations- und Verlängerungsexperimenten führen, die von kurzen zufälligen DNA-Strängen ausgehen. Solche Experimente könnten mit next-generation Sequenzierung analysiert werden, da die nativen Phosphodiesterbindungen an den Bindungsstellen entstehen. In Teil II wird MST verwendet, um einen diagnostischen Assay für α-Antitriypsin (AAT)-Mangel zu entwickeln, der direkt im Blutplasma funktioniert. Bei AAT-Mangel haben Einzelpersonen eine reduzierte Plasmakonzentration von AAT, was sie unter anderem anfällig für Lungenemphyseme macht. Überraschenderweise korreliert die Konzentration von AAT nicht mit dem Ausmass der Symptome. Bei einem Standard-MST-Ansatz ist die Amplitude der erhaltenen Bindungskurve für die Affinitätsanalyse nicht wichtig. In einem in dieser Arbeit vorgestellten MST-basierten kompetitiven Assay hängt die Amplitude der erhaltenen Bindungskurve sowohl von der Affinität der AAT-Bindung an ihr Target als auch von der Konzentration von AAT ab. In einem Proof-of-Principle-Experiment wurde das Blutplasma von Individuen mit AAT-Mangel zur Quantifizierung der Amplitude verwendet. Die Amplitude zeigte eine bessere Korrelation mit dem Ausmaß des Krankheitszustandes als die Konzentration von AAT allein, was darauf hindeutet, dass die Affinität von AAT zu seinem Target bei verschiedenen Individuen unterschiedlich ist. Die direkte Messung der AAT-Affinität zu ihrem Target im Plasma von Individuen mit starker vs. schwacher Manifestation der Symptome zeigte, dass die Affinität bei Individuen, die nur leicht betroffen waren, höher war. Dies deutet darauf hin, dass die Plasmazusammensetzung einen Einfluss auf die AAT-Affinität hat. In Teil III werden experimentelle Systeme entwickelt, um die stereochemische Theorie der Herkunft des genetischen Codes zu testen. Der genetische Code definiert die Zuordnung von 20 Aminosäuren zu ihren Codons. Die Hypothesen darüber, was die Zuordnung bestimmt hat, wurden in der Literatur ausführlich diskutiert, aber die Frage bleibt eine der experimentell anspruchsvollsten im Bereich des Ursprungs des Lebens. Die stereochemische Theorie besagt, dass Aminosäuren eine intrinsische Bindungsaffinität zu ihren Codons haben. Dies kann durch direkte Messung der Wechselwirkung zwischen den aktivierten Aminosäuren und codonhaltigen RNA-Strukturen getestet werden. Auf der Grundlage der Literaturrecherche wurden RNA-Strukturen entwickelt und die Affinität mit der MST-Methode gemessen. Proof-of-Principle-Experimente für drei RNA-Strukturen wurden durchgeführt, und ein Ansatz für die zukünftige Arbeit wird am Ende detailliert diskutiert.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
• Fakultäten: Fakultät für Physik
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 3. Dezember 2018
• 1. Bericht­erstatter:in: Braun, Dieter