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Etablierung eines Mastitisinfektionsmodells zur Untersuchung vorteilhafter Wirtsdeterminanten bei der Kuh
Etablierung eines Mastitisinfektionsmodells zur Untersuchung vorteilhafter Wirtsdeterminanten bei der Kuh
Die Mastitis des Rindes ist die häufigste Einzeltiererkrankung in der konventionellen Milchviehhaltung. Sie führt zu hohen wirtschaftlichen Verlusten und je nach auslösendem Pathogen zur starken Beeinträchtigung des Tierwohls. Insbesondere Staphylococcus aureus (S. aureus) und Escherichia coli (E. coli) als auslösende Pathogene spielen eine besondere Rolle und erzeugen zumeist sehr gegensätzliche Krank-heitsbilder. So löst S. aureus überwiegend subklinische/chronische Mastitiden aus, die durch ihre geringe Symptomatik und Neigung zur Erregerpersistenz im Euter besonders schwierig nachzuweisen und zu therapieren sind. E. coli dagegen löst vornehmlich akute klinische Mastitiden aus, die mit einer starken Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens der Tiere einhergehen kann. Beiden gemein ist, dass sie derzeit in der Regel mittels Antibiotika behandelt werden und der Therapieerfolg meist unbefriedigend ist. Im Hinblick auf die Produktion sicherer Lebensmittel aber auch in Hinblick auf die zunehmende Entwicklung resistenter Bakterienpopulationen gerät der Einsatz von Antibiotika bei Milchkühen zunehmend in die Kritik. Demnach sollte zukünftig der Fokus in der Mastitisforschung auf die Krankheitsvermeidung gelegt werden. Tierzüchterische Ansätze um, die Mastitisanfälligkeit von Kühen zu verringern, erscheinen hierbei vor allem zielführend. Ziel dieser Arbeit war es, auf der Basis eines neuen tierzüchterischen Ansatzes, ein Mastitisinfektionsmodell zur Untersuchung divergenter Genotypen während einer experimentell induzierten Mastitis bei Holstein-Friesian-(HF-)-Kühen zu entwickeln. Hierbei sollte untersucht werden, ob und wodurch sich die genetisch vorselektierten Kühe klinisch in der initialen Infektions- und Entzündungsphase während einer induzierten S. aureus- bzw. E. coli-Mastitis voneinander unterscheiden. Es wurden 36 HF-Färsen nach vorteilhaften (GQ) und unvorteilhaften (kq) paternalen Chromosom-18-Haplotypen hinsichtlich ihrer somatischen Zellzahl (SCC) in der Milch selektiert. Dabei diente die Zellzahl als Indikator für eine geringe (GQ) bzw. starke (kq) Mastitisemp-fänglichkeit. Die Aufstallung der hochtragenden Färsen erfolgte spätestens am Tag 259 der Trächtigkeit in Einzelboxen und 36 ± 3 Tage post partum wurden die Tiere experimentell intramammär mit S. aureus (n = 24) oder E. coli (n = 12) infiziert. Während der gesamten Versuchsdauer (S. aureus: 96 h, E. coli: 24 h) wurden die Kühe alle 12 Stunden (h) klinisch auf lokale und systemische Reaktionen untersucht. Weiterhin wurden Proben zur Bestimmung von Keimzahl, SCC und Inhaltstoffe in der Milch, sowie zur Analyse der Leukozytenzahl im Blut entnommen. Innerhalb des 36-tägigen Zeitraums vor der experimentellen Infektion unterschieden sich die divergenten Genotypen bereits im Hinblick auf ihre Eutergesundheit: So traten im Vorfeld sieben Mastitiden auf (GQ: n = 1 vs. kq = 6). Unmittelbar vor der Infektion jedoch unterschieden sich die Genotypen nicht hinsichtlich kli-nischer Parameter und erhobener Parameter in Milch und Blut. Eine Mastitis konnte nach experimenteller Infektion bei allen Probanden erfolgreich induziert werden. Dieses zeigte sich durch wiederholte Reisolation des Modellpathogens aus der Milch. Des Weiteren konnte sowohl nach S. aureus als auch nach E. coli-Infektion bei allen Tieren eine signifikante Erhöhung der somatischen Zellzahl festgestellt werden (S. aureus: P < 0,001; E. coli: P < 0,05). Weiterhin konnte ein Milchleistungsverlust von ca. 35 % bei einer Infektion mit S. aureus bzw. von ca. 50 % bei einer Infektion mit E. coli nachgewiesen werden. Signifikante Unterschiede zwischen den divergenten Genotypen GQ und kq zeigten sich nur bei den mit S. aureus-infizierten Kühen: So zeigten die GQ-Kühe zu den Zeitpunkten 24 h und 36 h p. inf. im Mittel einen signifikant geringeren SCC (24 h: P = 0,004; 36 h: P = 0,03), sowie 12 h p. inf. eine signifikant geringere Keimausscheidung als die kq-Kühe (P = 0,008). Auch die Gesamtmilchleistung der GQ-Kühe fiel 12 h und 24 h p. inf. signifikant weniger stark ab (12 h: P < 0,05; 24 h: P < 0,01). Auffällig war, dass die GQ-Kühe signifikant häufiger eine geschädigte Blut-Euter-Schranke (pH > 6,8) aufwiesen (48 h p. inf. und 60 h p. inf. P < 0,05) und 36 h p. inf. einen signifikant höheren Proteingehalt im Gesamtgemelk aufwiesen als die kq-Kühe (P < 0,05). Bei den mit E. coli-infizierten Tieren, zeigten sich keinerlei signifikante Unterschiede zwischen den divergenten Genotypen, außer dass die GQ-Kühe signifikant häufiger 12 h p. inf. einen signifikant höheren Proteingehalt im Gesamtgemelk aufwiesen als die kq-Kühe (P < 0,01). Alle infizierten Tiere entwickelten nachweislich durch die experimentelle Infektion eine Mastitis, die eine pathogenspezifische Ausprägung annahm. So konnte das Hauptziel dieser Arbeit, ein Mastitisinfektionsmodell zur Untersuchung divergenter Genotypen während einer experimentell induzierten Mastitis zu entwickeln, erfolgreich etabliert werden. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass sich die divergenten Genotypen in ihrer initialen Infektions- und Entzündungsphase während der induzierten S. aureus-Mastitis von-einander unterschieden. Ob diese Unterschiede dazu führen, dass die als vorteilhaft (GQ) selektierten Kühe eine geringere Mastitisempfänglichkeit zeigen, konnte bislang nicht gezeigt werden. Das im Rahmen dieser Arbeit etablierte Infektionsmodell ist Teil eines wissenschaftlichen Gesamtkonzepts und dient als Ausgangspunkt für eingehende Analysen gewonnenen Gewebematerials mittels modernster molekularbiologischer Verfahren. Die hieraus gewonnenen Erkenntnisse sollen helfen, zukünftig neue tierzüchterische Wege bei der Mastitisprophylaxe aufzuzeigen., Bovine mastitis is the most common disease in conventional dairy farming. Depending on the causative pathogen it may lead to high economic losses and significant impairment of animal welfare. Staphylococcus aureus (S. aureus) and Escherichia coli (E. coli) are considered as major pathogens, however they cause very different clinical pictures of the disease. S. aureus predominantly causes subclinical/chronic mastitis lacking clinical symptoms. Thus it is difficult to detect and to treat affected animals and the pathogens may persist within the udder for a long time. In contrast E. coli mainly causes acute clinical mastitis, which can be life threatening and severely affect the animals well-being. Treatment of mastitis still accounts for large parts of antibiotic usage in dairy cows, however its effectiveness against both named pathogens is often not successful. With regards to food safety and the growing development of antimicrobial-resistant bacteria, antibiotic treatment of dairy cows has increasingly raised public concern. Thus innovative mastitis research should focus on disease prevention. Specific breeding programs to optimise bovine mastitis susceptibility seem to be novel promising approaches. Based on detailed knowledge on the genomic variants modulating the target phenotype, the aim was to develop a mastitis infection model for examining divergent genotypes during an experimentally induced mastitis in Holstein-Friesian-(HF)-cows. We focused on investigating whether these genetically selected cows differ in their initial clinical response during intramammary infection (IMI) with S. aureus or E. coli. Thirty-six HF-heifers were selected for favourable (GQ) and unfavourable (kq) parental chromosome-18-haplotypes for somatic cell count (SCC) as a surrogate trait for mastitis sus-ceptibility. The SCC served as an indicator for low (GQ) or high (kq) mastitis susceptibility. The heifers were kept in individual pens from day 259 of gestation on and were challenged intramammary with S. aureus (n = 24) or E. coli (n = 12) on day 36 ± 3 post partum. Throughout the whole experiment (S. aureus: 96 h, E. coli: 24 h) the cows were examined every 12 hours (h) for local and systemic signs of mastitis. Furthermore samples were taken to determine the bacterial load, the SCC and the milk contents as well as to analyse the number of peripheral leukocytes in blood. Within the first 36 days of lactation, but before the challenge trial, the divergent genotypes differed regarding their udder health: In total, seven natural mastitis cases were recorded (GQ: n = 1 vs. kq = 6). However immediately before the experimental infection the divergent genotype groups did not differ regarding clinical parameters and laboratory parameters. Intramammary challenge successfully induced IMI and mastitis in all cows. This was shown by repeated recovery of S. aureus or E. coli in milk. In addition a significant increase of the SCC was assessed after S. aureus- as well as after E. coli-challenge (S. aureus: P < 0.001; E. coli: P < 0.05). Furthermore a decrease in milk yield of approximately 35 % during S. aureus IMI and of approximately 50 % during E. coli IMI was detected. Significant differences between the divergent genotypes GQ and kq could only be shown in S. aureus-infected cows: The GQ-cows showed a significant lower SCC than the kq-cows 24 h and 36 h p. inf. (24 h: P = 0.004; 36 h: P = 0.03) as well as a significant lower bacterial load in milk 12 h p. inf. (P = 0.008). GQ-cows showed a significant lower decrease in total milk yield 12 and 24 h p. inf. than the kq-cows (12 h: P < 0.05; 24 h: P < 0.01). Furthermore the GQ-cows showed significantly more often signs of a permeable blood milk barrier (pH > 6.8) (48 h p. inf. and 60 h p. inf. P < 0.05) and 36 h p. inf. a significantly higher protein content in composite milk samples than kq-cows (P < 0.05). For E. coli-infected cows no significant differences between the divergent genotypes were detected, except for a significantly higher protein content in composite milk samples of GQ-cows 12 h p. inf. (P < 0.01). All challenged cows developed pathogen-specific mastitis. Thus the main goal to develop a suitable mastitis infection model to study functional genetic variation of mastitis susceptibility in divergent genotypes was successfully achieved. Additionally we showed that the divergent genotypes differed in their initial inflammatory response to S. aureus IMI. Whether these differences imply a lower mastitis susceptibility in cows selected for favourable parental chromosome-18-haplotypes (GQ) cannot be concluded up to now. The established infection model within the framework of this thesis is a part of a scientific multidisciplinary concept and serves as origin for in-depth comprehensive subsequent immunological, endocrinological, immunohistochemical and transciptomic analyses. The scientific ouput will provide knowledge on the (patho)physiological backround of diver-gent mastitis susceptibility and will help developing future prophylactic concepts against bo-vine mastitis.
Mastitis, Infektionsmodell, BTA18, E. coli, S. aureus
Rohmeier, Laura
2018
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Rohmeier, Laura (2018): Etablierung eines Mastitisinfektionsmodells zur Untersuchung vorteilhafter Wirtsdeterminanten bei der Kuh. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Die Mastitis des Rindes ist die häufigste Einzeltiererkrankung in der konventionellen Milchviehhaltung. Sie führt zu hohen wirtschaftlichen Verlusten und je nach auslösendem Pathogen zur starken Beeinträchtigung des Tierwohls. Insbesondere Staphylococcus aureus (S. aureus) und Escherichia coli (E. coli) als auslösende Pathogene spielen eine besondere Rolle und erzeugen zumeist sehr gegensätzliche Krank-heitsbilder. So löst S. aureus überwiegend subklinische/chronische Mastitiden aus, die durch ihre geringe Symptomatik und Neigung zur Erregerpersistenz im Euter besonders schwierig nachzuweisen und zu therapieren sind. E. coli dagegen löst vornehmlich akute klinische Mastitiden aus, die mit einer starken Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens der Tiere einhergehen kann. Beiden gemein ist, dass sie derzeit in der Regel mittels Antibiotika behandelt werden und der Therapieerfolg meist unbefriedigend ist. Im Hinblick auf die Produktion sicherer Lebensmittel aber auch in Hinblick auf die zunehmende Entwicklung resistenter Bakterienpopulationen gerät der Einsatz von Antibiotika bei Milchkühen zunehmend in die Kritik. Demnach sollte zukünftig der Fokus in der Mastitisforschung auf die Krankheitsvermeidung gelegt werden. Tierzüchterische Ansätze um, die Mastitisanfälligkeit von Kühen zu verringern, erscheinen hierbei vor allem zielführend. Ziel dieser Arbeit war es, auf der Basis eines neuen tierzüchterischen Ansatzes, ein Mastitisinfektionsmodell zur Untersuchung divergenter Genotypen während einer experimentell induzierten Mastitis bei Holstein-Friesian-(HF-)-Kühen zu entwickeln. Hierbei sollte untersucht werden, ob und wodurch sich die genetisch vorselektierten Kühe klinisch in der initialen Infektions- und Entzündungsphase während einer induzierten S. aureus- bzw. E. coli-Mastitis voneinander unterscheiden. Es wurden 36 HF-Färsen nach vorteilhaften (GQ) und unvorteilhaften (kq) paternalen Chromosom-18-Haplotypen hinsichtlich ihrer somatischen Zellzahl (SCC) in der Milch selektiert. Dabei diente die Zellzahl als Indikator für eine geringe (GQ) bzw. starke (kq) Mastitisemp-fänglichkeit. Die Aufstallung der hochtragenden Färsen erfolgte spätestens am Tag 259 der Trächtigkeit in Einzelboxen und 36 ± 3 Tage post partum wurden die Tiere experimentell intramammär mit S. aureus (n = 24) oder E. coli (n = 12) infiziert. Während der gesamten Versuchsdauer (S. aureus: 96 h, E. coli: 24 h) wurden die Kühe alle 12 Stunden (h) klinisch auf lokale und systemische Reaktionen untersucht. Weiterhin wurden Proben zur Bestimmung von Keimzahl, SCC und Inhaltstoffe in der Milch, sowie zur Analyse der Leukozytenzahl im Blut entnommen. Innerhalb des 36-tägigen Zeitraums vor der experimentellen Infektion unterschieden sich die divergenten Genotypen bereits im Hinblick auf ihre Eutergesundheit: So traten im Vorfeld sieben Mastitiden auf (GQ: n = 1 vs. kq = 6). Unmittelbar vor der Infektion jedoch unterschieden sich die Genotypen nicht hinsichtlich kli-nischer Parameter und erhobener Parameter in Milch und Blut. Eine Mastitis konnte nach experimenteller Infektion bei allen Probanden erfolgreich induziert werden. Dieses zeigte sich durch wiederholte Reisolation des Modellpathogens aus der Milch. Des Weiteren konnte sowohl nach S. aureus als auch nach E. coli-Infektion bei allen Tieren eine signifikante Erhöhung der somatischen Zellzahl festgestellt werden (S. aureus: P < 0,001; E. coli: P < 0,05). Weiterhin konnte ein Milchleistungsverlust von ca. 35 % bei einer Infektion mit S. aureus bzw. von ca. 50 % bei einer Infektion mit E. coli nachgewiesen werden. Signifikante Unterschiede zwischen den divergenten Genotypen GQ und kq zeigten sich nur bei den mit S. aureus-infizierten Kühen: So zeigten die GQ-Kühe zu den Zeitpunkten 24 h und 36 h p. inf. im Mittel einen signifikant geringeren SCC (24 h: P = 0,004; 36 h: P = 0,03), sowie 12 h p. inf. eine signifikant geringere Keimausscheidung als die kq-Kühe (P = 0,008). Auch die Gesamtmilchleistung der GQ-Kühe fiel 12 h und 24 h p. inf. signifikant weniger stark ab (12 h: P < 0,05; 24 h: P < 0,01). Auffällig war, dass die GQ-Kühe signifikant häufiger eine geschädigte Blut-Euter-Schranke (pH > 6,8) aufwiesen (48 h p. inf. und 60 h p. inf. P < 0,05) und 36 h p. inf. einen signifikant höheren Proteingehalt im Gesamtgemelk aufwiesen als die kq-Kühe (P < 0,05). Bei den mit E. coli-infizierten Tieren, zeigten sich keinerlei signifikante Unterschiede zwischen den divergenten Genotypen, außer dass die GQ-Kühe signifikant häufiger 12 h p. inf. einen signifikant höheren Proteingehalt im Gesamtgemelk aufwiesen als die kq-Kühe (P < 0,01). Alle infizierten Tiere entwickelten nachweislich durch die experimentelle Infektion eine Mastitis, die eine pathogenspezifische Ausprägung annahm. So konnte das Hauptziel dieser Arbeit, ein Mastitisinfektionsmodell zur Untersuchung divergenter Genotypen während einer experimentell induzierten Mastitis zu entwickeln, erfolgreich etabliert werden. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass sich die divergenten Genotypen in ihrer initialen Infektions- und Entzündungsphase während der induzierten S. aureus-Mastitis von-einander unterschieden. Ob diese Unterschiede dazu führen, dass die als vorteilhaft (GQ) selektierten Kühe eine geringere Mastitisempfänglichkeit zeigen, konnte bislang nicht gezeigt werden. Das im Rahmen dieser Arbeit etablierte Infektionsmodell ist Teil eines wissenschaftlichen Gesamtkonzepts und dient als Ausgangspunkt für eingehende Analysen gewonnenen Gewebematerials mittels modernster molekularbiologischer Verfahren. Die hieraus gewonnenen Erkenntnisse sollen helfen, zukünftig neue tierzüchterische Wege bei der Mastitisprophylaxe aufzuzeigen.

Abstract

Bovine mastitis is the most common disease in conventional dairy farming. Depending on the causative pathogen it may lead to high economic losses and significant impairment of animal welfare. Staphylococcus aureus (S. aureus) and Escherichia coli (E. coli) are considered as major pathogens, however they cause very different clinical pictures of the disease. S. aureus predominantly causes subclinical/chronic mastitis lacking clinical symptoms. Thus it is difficult to detect and to treat affected animals and the pathogens may persist within the udder for a long time. In contrast E. coli mainly causes acute clinical mastitis, which can be life threatening and severely affect the animals well-being. Treatment of mastitis still accounts for large parts of antibiotic usage in dairy cows, however its effectiveness against both named pathogens is often not successful. With regards to food safety and the growing development of antimicrobial-resistant bacteria, antibiotic treatment of dairy cows has increasingly raised public concern. Thus innovative mastitis research should focus on disease prevention. Specific breeding programs to optimise bovine mastitis susceptibility seem to be novel promising approaches. Based on detailed knowledge on the genomic variants modulating the target phenotype, the aim was to develop a mastitis infection model for examining divergent genotypes during an experimentally induced mastitis in Holstein-Friesian-(HF)-cows. We focused on investigating whether these genetically selected cows differ in their initial clinical response during intramammary infection (IMI) with S. aureus or E. coli. Thirty-six HF-heifers were selected for favourable (GQ) and unfavourable (kq) parental chromosome-18-haplotypes for somatic cell count (SCC) as a surrogate trait for mastitis sus-ceptibility. The SCC served as an indicator for low (GQ) or high (kq) mastitis susceptibility. The heifers were kept in individual pens from day 259 of gestation on and were challenged intramammary with S. aureus (n = 24) or E. coli (n = 12) on day 36 ± 3 post partum. Throughout the whole experiment (S. aureus: 96 h, E. coli: 24 h) the cows were examined every 12 hours (h) for local and systemic signs of mastitis. Furthermore samples were taken to determine the bacterial load, the SCC and the milk contents as well as to analyse the number of peripheral leukocytes in blood. Within the first 36 days of lactation, but before the challenge trial, the divergent genotypes differed regarding their udder health: In total, seven natural mastitis cases were recorded (GQ: n = 1 vs. kq = 6). However immediately before the experimental infection the divergent genotype groups did not differ regarding clinical parameters and laboratory parameters. Intramammary challenge successfully induced IMI and mastitis in all cows. This was shown by repeated recovery of S. aureus or E. coli in milk. In addition a significant increase of the SCC was assessed after S. aureus- as well as after E. coli-challenge (S. aureus: P < 0.001; E. coli: P < 0.05). Furthermore a decrease in milk yield of approximately 35 % during S. aureus IMI and of approximately 50 % during E. coli IMI was detected. Significant differences between the divergent genotypes GQ and kq could only be shown in S. aureus-infected cows: The GQ-cows showed a significant lower SCC than the kq-cows 24 h and 36 h p. inf. (24 h: P = 0.004; 36 h: P = 0.03) as well as a significant lower bacterial load in milk 12 h p. inf. (P = 0.008). GQ-cows showed a significant lower decrease in total milk yield 12 and 24 h p. inf. than the kq-cows (12 h: P < 0.05; 24 h: P < 0.01). Furthermore the GQ-cows showed significantly more often signs of a permeable blood milk barrier (pH > 6.8) (48 h p. inf. and 60 h p. inf. P < 0.05) and 36 h p. inf. a significantly higher protein content in composite milk samples than kq-cows (P < 0.05). For E. coli-infected cows no significant differences between the divergent genotypes were detected, except for a significantly higher protein content in composite milk samples of GQ-cows 12 h p. inf. (P < 0.01). All challenged cows developed pathogen-specific mastitis. Thus the main goal to develop a suitable mastitis infection model to study functional genetic variation of mastitis susceptibility in divergent genotypes was successfully achieved. Additionally we showed that the divergent genotypes differed in their initial inflammatory response to S. aureus IMI. Whether these differences imply a lower mastitis susceptibility in cows selected for favourable parental chromosome-18-haplotypes (GQ) cannot be concluded up to now. The established infection model within the framework of this thesis is a part of a scientific multidisciplinary concept and serves as origin for in-depth comprehensive subsequent immunological, endocrinological, immunohistochemical and transciptomic analyses. The scientific ouput will provide knowledge on the (patho)physiological backround of diver-gent mastitis susceptibility and will help developing future prophylactic concepts against bo-vine mastitis.