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Single-molecule directed assembly and enzyme investigation
Single-molecule directed assembly and enzyme investigation
Einzelmolekül-Cut-and-Paste (SMC&P) ist eine vielseitige Technik im Feld der Nanotechnologie, die mittels der Kontrolle von einzelnen Molekülen Bottom-up-Assemblierungen ermöglicht. Mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops können Moleküle in beliebigen Mustern auf einer Oberfläche mit einer Genauigkeit in der Größenordnung von Nanometern angeordnet werden. So angeordnete Moleküle können dann über Fluoreszenzmikroskopie detektiert werden, was eine zeitaufgelöste Untersuchung auf Einzelmolekülebene ermöglicht. Die vorliegende Arbeit verfolgt die Integration funktioneller Enzyme als Transfermolekül in SMC&P. Im Prinzip können Enzyme über SMC&P auf einer Oberfläche angeordnet und deren Aktivität über floureszente Reaktionsprodukte beobachtet werden. Dies eröffnet spannende neue Möglichkeiten Enzyme auf Einzelmolekülebene zu untersuchen. Beispielsweise können Einzelmolekülmethoden wie SMC&P zeitaufgelöstes Enzymverhalten offenlegen, wie zum Beispiel die Existenz von Verzögerungsphasen oder spontanem Aktivitätsanstieg. Zusätzlich würde SMC&P auch eine statistische Analyse der Verteilung der katalytischen Aktivität in einer Population von Enzymen ermöglichen. Solche statistischen Analysen sind in Untersuchungen eines Gesamtensembles von Molekülen inhärent unmöglich, da nur das durchschnittliche Verhalten einer Population zu einem bestimmten Zeitpunkt berichtet beobachtet werden kann. Schließlich bietet die Fähigkeit, Moleküle auf einer Oberfläche spezifisch anzuordnen, die Möglichkeit, das dynamische katalytische Zusammenspiel zu untersuchen, wenn Enzyme in verschiedenen Mustern angeordnet sind, wodurch Informationen über geometrie- und dichteabhängige Prozesse gewonnen werden können. Werden mehrere verschiedene Enzyme zu einem multifunktionalen Netzwerk arrangiert, könnte das Zusammenspiel zwischen Enzymen, die für verschiedene Reaktionsstufen in komplexen biologischen Prozessen verantwortlich sind, besser verstanden und charakterisiert werden. Die zugrundeliegenden Arbeit wird zunächst durch einen Überblick über relevante Hintergrundinformationen in den wissentschaftlichen Kontext eingeordnet. Dies umfasst sowohl die Funktion von Enzymen aus einer biophysikalischen Perspektive, als auch eine Einführung in Technik und Theorie von Einzelmolekültechniken. Weiter werden die biochemischen, biophysikalischen und biotechnologischen Eigenschaften jedes näher beleuchteten Enzyms genauer diskutiert. Die benötigten Schlüsselmethoden in Molekularbiologie, Einzelmolekül-Kraftspektroskopie und Fluoreszenmikroskopie werden dargelegt. Es wurden umfangreiche Strategien für die Fluoreszenz- oder Biolumineszenz-Detektion jedes untersuchten Enzyms entworfen, um letztlich, Netzwerke von Enzymen mittels SMC&P zu schaffen. Gründliche Tests und Charakterisierungen potentiell interessanter Enzyme und deren jeweiligen Fluoreszenz-Auslesesysteme werden vorgestellt und diskutiert. Neben der Entwicklung von Strategien zur Enzymaktivitätsmessung wurde das Repertoire der SMC&P-Handhabungsstrategien erweitert. Darüber hinaus wird die erfolgreiche Implementierung eines komplett DNA-freien SMC&P-Systems demonstriert, das insbesondere für die Bottom-up-Assembly von DNA-bindenden Enzymen von vorteil ist. Dieser methodische Fortschritt ermöglicht ein potentiell neues Paradigma für zukünftige SMC&P-Experimente., Single-molecule cut-and-paste (SMC&P) is a versatile technique in the field of nanotechnology, merging bottom-up assembly and single-molecule directed control. With the aid of an atomic force microscope, molecules of interest are arranged in specifically designed patterns on a surface with precision on the order of nanometers. Arranged molecules may then be detected via fluorescence, enabling time-resolved analysis of single molecules. Soon after SMC&P was successfully tested as a proof of principle, it was quickly realized that this technique had great potential to investigate single-molecule activity beyond mere fluorescence. For example, DNA aptamers were assembled on the surface, forming sites in which a target ligand's structure was stabilized and its fluorescence enhanced. Furthermore, SMC&P offers absolute control of the placement of molecules on a surface, thereby circumventing many difficulties that arise from stochastic immobilization. For example, SMC&P enables precise placement of molecules within the center of nanoaperatures, decreasing the heterogeneity of fluorescence intensity and lifetime. The work presented in this thesis pursued integration of functional enzymes into SMC&P as transfer cargo. In concept, enzymes can be arranged on a surface via SMC&P, and their activities monitored via fluorescent output. This opens up several exciting possible avenues of enzyme investigations on the order of single molecules. Firstly, single-molecule measurements such as SMC&P can reveal time-resolved enzyme behavior, such as bursts of activity or periods of stalling. Additionally, with the assumption that the nontrivial process of protein folding leads to a spectrum of final folded states - and accordingly a spectrum of final functional states - SMC&P would also enable assessment of the distribution of catalytic activity within a population of enzymes. Such statistical analyses are inherently impossible in bulk studies, where only the mean behavior within a population at any given moment is reported. Lastly, the ability to specifically arrange molecules on a surface offers the possibility to investigate dynamic catalysis when enzymes are arranged in various patterns, gleaning information into geometry- and density-dependent processes. Moreover, were several different enzymes arranged into a multifunctional network, the interplay between enzymes that are responsible for different steps in complex biological processes could be better understood and characterized. Relevant background information to provide context of the scientific work is discussed in Chapters 1 - 3. An overview of enzyme function from a biophysical perspective is presented in Chapter 1. This chapter also discusses the heterogeneity of enzyme populations and the corresponding investigative value of single-enzyme analysis. Chapter 2 provides an introduction to the technology and theory pertinent to single-molecule probing. In particular, the AFM, total internal reflection fluorescence microscopy, and SMC&P are discussed. Chapter 3 elaborates on the the core library of enzymes of interest investigated in this work. The biochemical, biophysical, and biotechnological properties of each enzyme are discussed at length, providing a basis to understand the function of the enzymes within the framework of this thesis as well as the scientific community's general interest in these particular enzymes. The key methodologies utilized in this work are outlined in Chapters 4 and 5. Extensive molecular biology techniques were employed to design, express, purify and test enzymes of interest as well as related materials. Chapter 4 provides a broad description of these techniques, with particular attention given to non-standard methodologies or unique protocols developed for this work. Chapter 5 briefly describes the methods employed in single-molecule force spectroscopy and fluorescence microscopy within this work. The principle results in this thesis are detailed in Chapters 6 - 8. Unique strategies for fluorescent or bioluminescent readout were explored for each enzyme of interest, with the eventual goal of integrating networks of enzymes of interest into SMC&P. Rigorous testing and characterization of enzymes of interest and their respective fluorescence readout systems are presented and discussed in Chapter 6. In addition to development of enzyme activity measurement strategies, the repertoire of SMC\&P handling strategies was expanded. The incorporation of monovalent Strep-Tactin and its peptide ligand Strep-Tag II as a handling system between cantilever and transfer construct is presented in Chapter 7. Furthermore, the successful development of completely DNA-free SMC&P - which may prove advantageous for bottom-up assembly of DNA-binding enzymes - is introduced in Chapter 8. This methodological advancement in particular represents a potentially new paradigm for future SMC&P experiments.
single-molecule, AFM, single-molecule cut-and-paste, bottom-up assembly, enzyme activity, fluorescence, nanotechnology
Erlich, Katherine
2018
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Erlich, Katherine (2018): Single-molecule directed assembly and enzyme investigation. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
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Erlich_Katherine.pdf

172MB

Abstract

Einzelmolekül-Cut-and-Paste (SMC&P) ist eine vielseitige Technik im Feld der Nanotechnologie, die mittels der Kontrolle von einzelnen Molekülen Bottom-up-Assemblierungen ermöglicht. Mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops können Moleküle in beliebigen Mustern auf einer Oberfläche mit einer Genauigkeit in der Größenordnung von Nanometern angeordnet werden. So angeordnete Moleküle können dann über Fluoreszenzmikroskopie detektiert werden, was eine zeitaufgelöste Untersuchung auf Einzelmolekülebene ermöglicht. Die vorliegende Arbeit verfolgt die Integration funktioneller Enzyme als Transfermolekül in SMC&P. Im Prinzip können Enzyme über SMC&P auf einer Oberfläche angeordnet und deren Aktivität über floureszente Reaktionsprodukte beobachtet werden. Dies eröffnet spannende neue Möglichkeiten Enzyme auf Einzelmolekülebene zu untersuchen. Beispielsweise können Einzelmolekülmethoden wie SMC&P zeitaufgelöstes Enzymverhalten offenlegen, wie zum Beispiel die Existenz von Verzögerungsphasen oder spontanem Aktivitätsanstieg. Zusätzlich würde SMC&P auch eine statistische Analyse der Verteilung der katalytischen Aktivität in einer Population von Enzymen ermöglichen. Solche statistischen Analysen sind in Untersuchungen eines Gesamtensembles von Molekülen inhärent unmöglich, da nur das durchschnittliche Verhalten einer Population zu einem bestimmten Zeitpunkt berichtet beobachtet werden kann. Schließlich bietet die Fähigkeit, Moleküle auf einer Oberfläche spezifisch anzuordnen, die Möglichkeit, das dynamische katalytische Zusammenspiel zu untersuchen, wenn Enzyme in verschiedenen Mustern angeordnet sind, wodurch Informationen über geometrie- und dichteabhängige Prozesse gewonnen werden können. Werden mehrere verschiedene Enzyme zu einem multifunktionalen Netzwerk arrangiert, könnte das Zusammenspiel zwischen Enzymen, die für verschiedene Reaktionsstufen in komplexen biologischen Prozessen verantwortlich sind, besser verstanden und charakterisiert werden. Die zugrundeliegenden Arbeit wird zunächst durch einen Überblick über relevante Hintergrundinformationen in den wissentschaftlichen Kontext eingeordnet. Dies umfasst sowohl die Funktion von Enzymen aus einer biophysikalischen Perspektive, als auch eine Einführung in Technik und Theorie von Einzelmolekültechniken. Weiter werden die biochemischen, biophysikalischen und biotechnologischen Eigenschaften jedes näher beleuchteten Enzyms genauer diskutiert. Die benötigten Schlüsselmethoden in Molekularbiologie, Einzelmolekül-Kraftspektroskopie und Fluoreszenmikroskopie werden dargelegt. Es wurden umfangreiche Strategien für die Fluoreszenz- oder Biolumineszenz-Detektion jedes untersuchten Enzyms entworfen, um letztlich, Netzwerke von Enzymen mittels SMC&P zu schaffen. Gründliche Tests und Charakterisierungen potentiell interessanter Enzyme und deren jeweiligen Fluoreszenz-Auslesesysteme werden vorgestellt und diskutiert. Neben der Entwicklung von Strategien zur Enzymaktivitätsmessung wurde das Repertoire der SMC&P-Handhabungsstrategien erweitert. Darüber hinaus wird die erfolgreiche Implementierung eines komplett DNA-freien SMC&P-Systems demonstriert, das insbesondere für die Bottom-up-Assembly von DNA-bindenden Enzymen von vorteil ist. Dieser methodische Fortschritt ermöglicht ein potentiell neues Paradigma für zukünftige SMC&P-Experimente.

Abstract

Single-molecule cut-and-paste (SMC&P) is a versatile technique in the field of nanotechnology, merging bottom-up assembly and single-molecule directed control. With the aid of an atomic force microscope, molecules of interest are arranged in specifically designed patterns on a surface with precision on the order of nanometers. Arranged molecules may then be detected via fluorescence, enabling time-resolved analysis of single molecules. Soon after SMC&P was successfully tested as a proof of principle, it was quickly realized that this technique had great potential to investigate single-molecule activity beyond mere fluorescence. For example, DNA aptamers were assembled on the surface, forming sites in which a target ligand's structure was stabilized and its fluorescence enhanced. Furthermore, SMC&P offers absolute control of the placement of molecules on a surface, thereby circumventing many difficulties that arise from stochastic immobilization. For example, SMC&P enables precise placement of molecules within the center of nanoaperatures, decreasing the heterogeneity of fluorescence intensity and lifetime. The work presented in this thesis pursued integration of functional enzymes into SMC&P as transfer cargo. In concept, enzymes can be arranged on a surface via SMC&P, and their activities monitored via fluorescent output. This opens up several exciting possible avenues of enzyme investigations on the order of single molecules. Firstly, single-molecule measurements such as SMC&P can reveal time-resolved enzyme behavior, such as bursts of activity or periods of stalling. Additionally, with the assumption that the nontrivial process of protein folding leads to a spectrum of final folded states - and accordingly a spectrum of final functional states - SMC&P would also enable assessment of the distribution of catalytic activity within a population of enzymes. Such statistical analyses are inherently impossible in bulk studies, where only the mean behavior within a population at any given moment is reported. Lastly, the ability to specifically arrange molecules on a surface offers the possibility to investigate dynamic catalysis when enzymes are arranged in various patterns, gleaning information into geometry- and density-dependent processes. Moreover, were several different enzymes arranged into a multifunctional network, the interplay between enzymes that are responsible for different steps in complex biological processes could be better understood and characterized. Relevant background information to provide context of the scientific work is discussed in Chapters 1 - 3. An overview of enzyme function from a biophysical perspective is presented in Chapter 1. This chapter also discusses the heterogeneity of enzyme populations and the corresponding investigative value of single-enzyme analysis. Chapter 2 provides an introduction to the technology and theory pertinent to single-molecule probing. In particular, the AFM, total internal reflection fluorescence microscopy, and SMC&P are discussed. Chapter 3 elaborates on the the core library of enzymes of interest investigated in this work. The biochemical, biophysical, and biotechnological properties of each enzyme are discussed at length, providing a basis to understand the function of the enzymes within the framework of this thesis as well as the scientific community's general interest in these particular enzymes. The key methodologies utilized in this work are outlined in Chapters 4 and 5. Extensive molecular biology techniques were employed to design, express, purify and test enzymes of interest as well as related materials. Chapter 4 provides a broad description of these techniques, with particular attention given to non-standard methodologies or unique protocols developed for this work. Chapter 5 briefly describes the methods employed in single-molecule force spectroscopy and fluorescence microscopy within this work. The principle results in this thesis are detailed in Chapters 6 - 8. Unique strategies for fluorescent or bioluminescent readout were explored for each enzyme of interest, with the eventual goal of integrating networks of enzymes of interest into SMC&P. Rigorous testing and characterization of enzymes of interest and their respective fluorescence readout systems are presented and discussed in Chapter 6. In addition to development of enzyme activity measurement strategies, the repertoire of SMC\&P handling strategies was expanded. The incorporation of monovalent Strep-Tactin and its peptide ligand Strep-Tag II as a handling system between cantilever and transfer construct is presented in Chapter 7. Furthermore, the successful development of completely DNA-free SMC&P - which may prove advantageous for bottom-up assembly of DNA-binding enzymes - is introduced in Chapter 8. This methodological advancement in particular represents a potentially new paradigm for future SMC&P experiments.