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DNA origami scaffolds to control lipid membrane shape
DNA origami scaffolds to control lipid membrane shape
Gerüstproteine, beispielweise Proteine der Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR) Domänen Familie, vermitteln und regulieren durch ihre Membranbindung und Selbstorganisation die Verformungen von Zellmembranen. Die quantitative Charakterisierung der Interaktionen von synthetischen Gerüst-Molekülen mit Lipidmembranen unter kontrollierten Bedingungen kann fundamental zu unserem Verständnis der physikalischen Prinzipien beitragen, die diesen Membranverformungsphänomenen zugrunde liegen. In dieser Arbeit wurde daher die DNA-Origami-Technologie verwendet, um Funktionselemente zu schaffen, die die physikalischen Eigenschaften von Gerüstproteinen aufweisen und Lipidmembranen kontrolliert deformieren können. Zunächst wurden die Vorrausetzungen bestimmt, unter denen stark negativ geladene DNA Nanostrukturen effizient an Membranen binden. Ich zeige, dass Cholesterin-Anker, die nahe an den sperrigen DNA Nanostrukturen positioniert sind, lokal an der Membranbindung gehindert sind, und dass das Vorhandensein mehrere Cholesterin-Anker oder das Einführen von DNA-„Abstandshaltern“ die Membranbindung verstärkt. Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) Daten zeigen, dass sowohl die Anzahl als auch die Art der DNA-„Abstandshalter“ die Interaktionen der DNA-Nanostrukturen mit Lipiddoppelmembranen bestimmen. Zusätzlich zu Experimenten mit Doppelmembranen haben wir auch die experimentellen Bedingungen für FCS Experimente etabliert, die die Interaktionen von Makromolekülen und Lipidfilmen untersuchen. Untersuchungen der Selbstorganisation von DNA-Origami-Nanostrukturen auf Lipidmembranen mittels Hochgeschwindigkeits-Atomkraftmikroskopie (HSAFM) haben aufgedeckt, dass per se rein repulsive DNA Nanostrukturen auf Lipidmembranen sowohl Spitze-an-Spitze als auch Seite-an-Seite Kontakte ausbilden, und sich damit anisotropische Domänen bilden. Die bevorzugte Art der Interaktion hängt von der Oberflächendichte der Teilchen und damit der Membranspannung ab. Ich zeige auch, dass man DNA-Nanostrukturen nutzen kann, um 2D Phasenübergänge (iso- zu anisotrop) von Teilchen verschiedener Aspektverhältnisse zu untersuchen. Zuletzt verwenden wir DNA-Nanostrukturen, um Lipidmembrane zu verformen und dabei die Funktionen von Gerüstproteinen nachzuempfinden. Wir zeigen, dass Lipidmembranen von gekrümmte DNA-Gerüsten Tubus-förmig geformt werden, die damit nicht nur die Form, sondern auch die Wirkung von BAR Proteinen nachstellen können. Die Verformung der Lipidmembran korrelierte mit der Krümmung der DNA-Gerüste und deren Dichte auf der Membran. Um Membranen dynamisch und kontrolliert verformen zu können, habe ich eine DNA-Origamistruktur entworfen, die drei Zustände hat, und die von ihrer passiven in ihre Membran-verformende Konformation geschaltet werden kann. Um das Design zu optimieren wurde ein komplementärer Ansatz in Form von oxDNA Molekül-Dynamik-Simulationen (MD Simulationen) und Transmissionselektronen-mikroskopie (TEM) verwendet., Membrane-binding and self-organization of scaffolding proteins, e.g. Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR) domain family, mediates and regulates the shape transformations of cell membranes. The quantitative characterization of the interaction of synthetic scaffolds with lipid membranes in defined conditions will greatly add to our understanding of the fundamental physical principles driving membrane-shaping phenomena. In this work, DNA origami technology was used to create elements that bear physical features of scaffolding proteins and controllably shape lipid membranes. First, I determined the requirements for efficient membrane-binding of highly negatively charged DNA nanostructures. I show that cholesteryl-anchors positioned close to the bulky DNA nanostructures are locally hindered, and that multiple cholesteryl-anchors or DNA spacers can enhance membrane binding. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) data demonstrates that both the number and type of DNA spacer determine the interaction of DNA nanostructures with lipid bilayers. In addition to bilayers, we established conditions for FCS experiments investigating macromolecule-lipid monolayer interactions. Studies of the self-organization of DNA origami nanostructures on lipid membranes using high speed atomic force microscopy (HSAFM) revealed that both tip-to-tip and side-by-side interactions, and the resulting anisotropic domains, are observed on lipid membranes for per se purely repulsive DNA nanostructures. The preferred type of interaction depends on the particle surface density and thus membrane tension. I also demonstrate the use of DNA nanostructures for the study of isotropic-anisotropic phase transition of particles of different aspect-ratios in 2D. Last, we employ DNA nanostructures to shape lipid membranes, mimicking the function of scaffolding proteins. We show that curved DNA scaffolds tubulate lipid membranes, resembling not only the shape but also the action of BAR proteins. Lipid membrane deformation was correlated to the DNA scaffolds’ curvature and membrane density. To dynamically control membrane shaping, I present the design of a three-state DNA origami structure that can be switched from its passive to its active membrane-shaping conformation. A complementary approach of oxDNA molecular dynamic simulations (MD simulations) and transmission electron microscopy (TEM) imaging was used to optimize the design.
Not available
Khmelinskaia, Alena
2018
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Khmelinskaia, Alena (2018): DNA origami scaffolds to control lipid membrane shape. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
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Khmelinskaia_Alena.pdf

58MB

Abstract

Gerüstproteine, beispielweise Proteine der Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR) Domänen Familie, vermitteln und regulieren durch ihre Membranbindung und Selbstorganisation die Verformungen von Zellmembranen. Die quantitative Charakterisierung der Interaktionen von synthetischen Gerüst-Molekülen mit Lipidmembranen unter kontrollierten Bedingungen kann fundamental zu unserem Verständnis der physikalischen Prinzipien beitragen, die diesen Membranverformungsphänomenen zugrunde liegen. In dieser Arbeit wurde daher die DNA-Origami-Technologie verwendet, um Funktionselemente zu schaffen, die die physikalischen Eigenschaften von Gerüstproteinen aufweisen und Lipidmembranen kontrolliert deformieren können. Zunächst wurden die Vorrausetzungen bestimmt, unter denen stark negativ geladene DNA Nanostrukturen effizient an Membranen binden. Ich zeige, dass Cholesterin-Anker, die nahe an den sperrigen DNA Nanostrukturen positioniert sind, lokal an der Membranbindung gehindert sind, und dass das Vorhandensein mehrere Cholesterin-Anker oder das Einführen von DNA-„Abstandshaltern“ die Membranbindung verstärkt. Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) Daten zeigen, dass sowohl die Anzahl als auch die Art der DNA-„Abstandshalter“ die Interaktionen der DNA-Nanostrukturen mit Lipiddoppelmembranen bestimmen. Zusätzlich zu Experimenten mit Doppelmembranen haben wir auch die experimentellen Bedingungen für FCS Experimente etabliert, die die Interaktionen von Makromolekülen und Lipidfilmen untersuchen. Untersuchungen der Selbstorganisation von DNA-Origami-Nanostrukturen auf Lipidmembranen mittels Hochgeschwindigkeits-Atomkraftmikroskopie (HSAFM) haben aufgedeckt, dass per se rein repulsive DNA Nanostrukturen auf Lipidmembranen sowohl Spitze-an-Spitze als auch Seite-an-Seite Kontakte ausbilden, und sich damit anisotropische Domänen bilden. Die bevorzugte Art der Interaktion hängt von der Oberflächendichte der Teilchen und damit der Membranspannung ab. Ich zeige auch, dass man DNA-Nanostrukturen nutzen kann, um 2D Phasenübergänge (iso- zu anisotrop) von Teilchen verschiedener Aspektverhältnisse zu untersuchen. Zuletzt verwenden wir DNA-Nanostrukturen, um Lipidmembrane zu verformen und dabei die Funktionen von Gerüstproteinen nachzuempfinden. Wir zeigen, dass Lipidmembranen von gekrümmte DNA-Gerüsten Tubus-förmig geformt werden, die damit nicht nur die Form, sondern auch die Wirkung von BAR Proteinen nachstellen können. Die Verformung der Lipidmembran korrelierte mit der Krümmung der DNA-Gerüste und deren Dichte auf der Membran. Um Membranen dynamisch und kontrolliert verformen zu können, habe ich eine DNA-Origamistruktur entworfen, die drei Zustände hat, und die von ihrer passiven in ihre Membran-verformende Konformation geschaltet werden kann. Um das Design zu optimieren wurde ein komplementärer Ansatz in Form von oxDNA Molekül-Dynamik-Simulationen (MD Simulationen) und Transmissionselektronen-mikroskopie (TEM) verwendet.

Abstract

Membrane-binding and self-organization of scaffolding proteins, e.g. Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR) domain family, mediates and regulates the shape transformations of cell membranes. The quantitative characterization of the interaction of synthetic scaffolds with lipid membranes in defined conditions will greatly add to our understanding of the fundamental physical principles driving membrane-shaping phenomena. In this work, DNA origami technology was used to create elements that bear physical features of scaffolding proteins and controllably shape lipid membranes. First, I determined the requirements for efficient membrane-binding of highly negatively charged DNA nanostructures. I show that cholesteryl-anchors positioned close to the bulky DNA nanostructures are locally hindered, and that multiple cholesteryl-anchors or DNA spacers can enhance membrane binding. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) data demonstrates that both the number and type of DNA spacer determine the interaction of DNA nanostructures with lipid bilayers. In addition to bilayers, we established conditions for FCS experiments investigating macromolecule-lipid monolayer interactions. Studies of the self-organization of DNA origami nanostructures on lipid membranes using high speed atomic force microscopy (HSAFM) revealed that both tip-to-tip and side-by-side interactions, and the resulting anisotropic domains, are observed on lipid membranes for per se purely repulsive DNA nanostructures. The preferred type of interaction depends on the particle surface density and thus membrane tension. I also demonstrate the use of DNA nanostructures for the study of isotropic-anisotropic phase transition of particles of different aspect-ratios in 2D. Last, we employ DNA nanostructures to shape lipid membranes, mimicking the function of scaffolding proteins. We show that curved DNA scaffolds tubulate lipid membranes, resembling not only the shape but also the action of BAR proteins. Lipid membrane deformation was correlated to the DNA scaffolds’ curvature and membrane density. To dynamically control membrane shaping, I present the design of a three-state DNA origami structure that can be switched from its passive to its active membrane-shaping conformation. A complementary approach of oxDNA molecular dynamic simulations (MD simulations) and transmission electron microscopy (TEM) imaging was used to optimize the design.