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Towards efficient siRNA delivery and gene silencing kinetics on the single cell level
Towards efficient siRNA delivery and gene silencing kinetics on the single cell level
RNA interference (RNAi) is a natural sequence-specific mechanism of post-transcriptional gene regulation leaded by short, double stranded RNA fragments e.g. small interfering RNAs (siRNA). Despite its high therapeutic potential, the safe and efficient systemic delivery of siRNAs into a large number of diseased cells to trigger therapeutic gene knockdown remains challenging. Moreover, novel quantitative methods for assessing activity of siRNA-based therapeutic agents in a fast and precise manner are needed. In this work, we firstly developed the folate-targeted monomolecular nucleic acid/lipid particles (FolA-mNALPs) formed using microfluidic-based method and studied their functionality regarding prospective use as a siRNA delivery agent. Secondly, we quantify the single-cell kinetics of siRNA-mediated gene silencing using micro-patterned cell cultivation substrates combined with time-lapse fluorescence microscopy (life-cell imaging on single-cell arrays, LISCA). In particular, we demonstrate that microfluidic self-assembly combined with rational design of lipid formulation results in nanoparticles of small size and narrow size distribution that in average contain single siRNA molecule covered with a single lipid bilayer (mNALP). We investigate the stability of folate-functionalized mNALPs in biological fluids, and their biological performance in terms of cellular internalisation and silencing efficiency. Small sizes, efficient targeting and presented silencing capability following facilitated endosomal release make mNALP a promising system for the future development of an in vivo siRNA delivery agent. Furthermore, using LISCA we investigate the magnitude of siRNA-induced mRNA degradation. By mathematical modelling of gene expression and fitting of expression time-courses we obtain the population distributions of rate constants related with the model, including single-cell mRNA degradation rate constants. The expression time-courses are gained by monitoring the dynamic changes in single-cell fluorescence intensities of reporter proteins (eGFP target and CayRFP reference). Obtained kinetic parameters allow us to quantify the silencing efficiency as the relative fold-change in mRNA degradation rate constants, to identify the subpopulations of cells affected by siRNA activity and, by analysis of correlations between kinetic parameters of CayRFP and eGFP expression, to infer on the properties of mRNA delivery and expression kinetics. Presented approach allows for the precise quantification of the activity of siRNA-based therapeutics in an accurate and fast (<30h) manner based on the analysis of time-independent kinetic parameters describing the silencing process., RNA-Interferenz (RNAi) ist ein natürlicher Mechanismus der posttranskriptionalen Genregulation in eukaryotischen Zellen. RNAi kann spezifische Gene ansteuern und bietet hohe Flexilitiät in der Wahl der angesteuerten mRNA Sequenzregionen.Diese beiden Charakteristika machen RNAi zu einem vielseitigen Werkzeug bei der Untersuchung von Genfunktionen und zu einem möglichen Therapeutikum für eine große Vielfalt an Erkrankungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden a) eine mikrofluidik-basierte Methode zur verbesserten Selbst-Assemblierung von monomolekularen Nukleinsäure/ -lipidteilchen (mNALPs) für ihren möglichen zukünftigen Nutzen als siRNA-Lieferant entwickelt und b) die Einzelzellantworten auf siRNA-induzierte Genstilllegung untersucht. Wir bestimmen insbesondere die optimalen Parameter für die Selbst-Assemblierung von mNALPs, untersuchen deren Stabilität in biologischen Flüssigkeiten und ihre Wirkungsweise bezüglich zelltypspezifischer Internalisierung und Stilllegungseffizienz in in-vitro Zellexperimenten. Des Weiteren verwenden wir Lebendzell-Videomikroskopie auf mikrostrukturierten Substraten („live-cell imaging on single cell arrys“, LISCA) um die, durch siRNA-Aktivität induzierte, relative Veränderung der mRNA-Degradierungsratenkonstanten zu untersuchen.Eine Aussage über die Stärke der siRNA-induzierten mRNA Degradierung kann durch das mathematische Modell der Genexpression und das Fitten der Fluoreszenz-Zeitkurven getroffen werden, die aus den dynamischen Veränderungen in der Einzelzellfluoreszenzintensitäten der Reporterproteine gewonnen wird. Diese Prozedur liefert die Populationsverteilung von Ratenkonstanten, welche mit dem Modell verbunden sind. Dadurch können wir die Effizienz der Gen-Stilllegung als relative Veränderung der mRNA-Degradationsratenkonstanten quantifizieren und zusätzlich Subpopulationen von Zellen identifizieren, welche von der siRNA-Aktivität nicht betroffen sind. Zudem kann die Analyse der Korrelationen zwischen den kinetischen Parametern der CayRFP- und eGFP-Expressionen einen Rückschluss auf die Eigenschaften der mRNA-Lieferung der Expressionskinetik erlauben. Die nanoskalige Größe, Stabilität, spezifisches Targeting und die demonstrierte spezifische Stillegung eines Gens, machen mNALP zu einer vielversprechenden Grundlage für ein zukünftiges in-vivo siRNA-Transfersystems. Zudem stellen wir die mikroskopiebasierte Methode LISCA vor, welche eine präzise Quantifizierung der Aktivität von siRNA-basierten Therapeutika erlaubt. Auf akkurate und schnelle Weise (< 30h) können damit zeitabhängige kinetische Parameter, welche den Stillegungsprozess von Genen beschreiben, gewonnen werden.
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Krzysztoń, Rafał Stanisław
2018
Englisch
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Krzysztoń, Rafał Stanisław (2018): Towards efficient siRNA delivery and gene silencing kinetics on the single cell level. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik
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Abstract

RNA interference (RNAi) is a natural sequence-specific mechanism of post-transcriptional gene regulation leaded by short, double stranded RNA fragments e.g. small interfering RNAs (siRNA). Despite its high therapeutic potential, the safe and efficient systemic delivery of siRNAs into a large number of diseased cells to trigger therapeutic gene knockdown remains challenging. Moreover, novel quantitative methods for assessing activity of siRNA-based therapeutic agents in a fast and precise manner are needed. In this work, we firstly developed the folate-targeted monomolecular nucleic acid/lipid particles (FolA-mNALPs) formed using microfluidic-based method and studied their functionality regarding prospective use as a siRNA delivery agent. Secondly, we quantify the single-cell kinetics of siRNA-mediated gene silencing using micro-patterned cell cultivation substrates combined with time-lapse fluorescence microscopy (life-cell imaging on single-cell arrays, LISCA). In particular, we demonstrate that microfluidic self-assembly combined with rational design of lipid formulation results in nanoparticles of small size and narrow size distribution that in average contain single siRNA molecule covered with a single lipid bilayer (mNALP). We investigate the stability of folate-functionalized mNALPs in biological fluids, and their biological performance in terms of cellular internalisation and silencing efficiency. Small sizes, efficient targeting and presented silencing capability following facilitated endosomal release make mNALP a promising system for the future development of an in vivo siRNA delivery agent. Furthermore, using LISCA we investigate the magnitude of siRNA-induced mRNA degradation. By mathematical modelling of gene expression and fitting of expression time-courses we obtain the population distributions of rate constants related with the model, including single-cell mRNA degradation rate constants. The expression time-courses are gained by monitoring the dynamic changes in single-cell fluorescence intensities of reporter proteins (eGFP target and CayRFP reference). Obtained kinetic parameters allow us to quantify the silencing efficiency as the relative fold-change in mRNA degradation rate constants, to identify the subpopulations of cells affected by siRNA activity and, by analysis of correlations between kinetic parameters of CayRFP and eGFP expression, to infer on the properties of mRNA delivery and expression kinetics. Presented approach allows for the precise quantification of the activity of siRNA-based therapeutics in an accurate and fast (<30h) manner based on the analysis of time-independent kinetic parameters describing the silencing process.

Abstract

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein natürlicher Mechanismus der posttranskriptionalen Genregulation in eukaryotischen Zellen. RNAi kann spezifische Gene ansteuern und bietet hohe Flexilitiät in der Wahl der angesteuerten mRNA Sequenzregionen.Diese beiden Charakteristika machen RNAi zu einem vielseitigen Werkzeug bei der Untersuchung von Genfunktionen und zu einem möglichen Therapeutikum für eine große Vielfalt an Erkrankungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden a) eine mikrofluidik-basierte Methode zur verbesserten Selbst-Assemblierung von monomolekularen Nukleinsäure/ -lipidteilchen (mNALPs) für ihren möglichen zukünftigen Nutzen als siRNA-Lieferant entwickelt und b) die Einzelzellantworten auf siRNA-induzierte Genstilllegung untersucht. Wir bestimmen insbesondere die optimalen Parameter für die Selbst-Assemblierung von mNALPs, untersuchen deren Stabilität in biologischen Flüssigkeiten und ihre Wirkungsweise bezüglich zelltypspezifischer Internalisierung und Stilllegungseffizienz in in-vitro Zellexperimenten. Des Weiteren verwenden wir Lebendzell-Videomikroskopie auf mikrostrukturierten Substraten („live-cell imaging on single cell arrys“, LISCA) um die, durch siRNA-Aktivität induzierte, relative Veränderung der mRNA-Degradierungsratenkonstanten zu untersuchen.Eine Aussage über die Stärke der siRNA-induzierten mRNA Degradierung kann durch das mathematische Modell der Genexpression und das Fitten der Fluoreszenz-Zeitkurven getroffen werden, die aus den dynamischen Veränderungen in der Einzelzellfluoreszenzintensitäten der Reporterproteine gewonnen wird. Diese Prozedur liefert die Populationsverteilung von Ratenkonstanten, welche mit dem Modell verbunden sind. Dadurch können wir die Effizienz der Gen-Stilllegung als relative Veränderung der mRNA-Degradationsratenkonstanten quantifizieren und zusätzlich Subpopulationen von Zellen identifizieren, welche von der siRNA-Aktivität nicht betroffen sind. Zudem kann die Analyse der Korrelationen zwischen den kinetischen Parametern der CayRFP- und eGFP-Expressionen einen Rückschluss auf die Eigenschaften der mRNA-Lieferung der Expressionskinetik erlauben. Die nanoskalige Größe, Stabilität, spezifisches Targeting und die demonstrierte spezifische Stillegung eines Gens, machen mNALP zu einer vielversprechenden Grundlage für ein zukünftiges in-vivo siRNA-Transfersystems. Zudem stellen wir die mikroskopiebasierte Methode LISCA vor, welche eine präzise Quantifizierung der Aktivität von siRNA-basierten Therapeutika erlaubt. Auf akkurate und schnelle Weise (< 30h) können damit zeitabhängige kinetische Parameter, welche den Stillegungsprozess von Genen beschreiben, gewonnen werden.