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Evidenzbasierte Belastungseinstufung von Epilepsiemodellen. Untersuchungen im Amygdala-Kindling-Modell bei Ratten
Evidenzbasierte Belastungseinstufung von Epilepsiemodellen. Untersuchungen im Amygdala-Kindling-Modell bei Ratten
Epilepsien stellen sowohl in der Veterinär- als auch in der Humanmedizin eine der häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen weltweit dar. In beiden Fällen lassen sich die Anfälle bei etwa 30 % der Patienten nicht medikamentös kontrollieren. Daher ist es essentiell neue Angriffsstrukturen für Antiepileptika zu identifizieren. Das hierfür notwendige Verständnis der pathophysiologischen Hintergründe von Epilepsien und die Entwicklung der bisherigen drei Generationen von Antiepileptika basiert hauptsächlich auf der Durchführung von Tierversuchen. Zusätzlich zu den Versuchstieren, die in der Epilepsieforschung eingesetzt werden, treten auch bei Versuchstieren in vielen anderen Forschungsbereichen Anfälle auf. In welchem Ausmaß die versuchsbedingten Prozeduren sowie die Anfälle selbst eine Belastung für die Tiere darstellen, ist bisher nicht geklärt. In der europäischen Union ist in der Richtlinie 2010/63/EU gesetzlich festgehalten, dass der Nutzen jedes Tierversuchs die den Tieren zugefügten Schmerzen, Leiden und Schäden übersteigen muss. Der auf die Versuchstiere einwirkende Stress beeinflusst zudem die Qualität der erhobenen Daten. Eine evidenzbasierte Belastungseinstufung von Epilepsiemodellen und den dabei auftretenden epileptischen Anfällen ist daher als Grundlage für die Entscheidungen von Behörden und Forschergruppen im Rahmen der Durchführung von Tierversuchen dringend notwendig. Als Teilprojekt einer nationalen Forschungsgemeinschaft, deren Fokus auf der evidenzbasierten Belastungseinstufung liegt, wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von wiederholten epileptischen Anfällen auf das Wohlbefinden von Ratten untersucht. Hierfür wurden verschiedene Verhaltensuntersuchungen durchgeführt, um das Heimkäfigverhalten, das Sozialverhalten, das Grabverhalten und das angst- und depressionsassoziierte Verhalten der Tiere zu untersuchen. Des Weiteren wurden biochemische Stressparameter in Serum-, Kot- und Haarproben evaluiert und mit Hilfe implantierter Telemetrie-Transmitter die lokomotorische Aktivität sowie die Herzfrequenz der Tiere erfasst. Dadurch konnten umfassende Informationen über die Verhaltensänderungen sowie die Änderungen biochemischer und physiologischer Parameter im Amygdala-Kindling-Modell erhoben werden. Diese Daten ermöglichen Rückschlüsse auf eine durch das Modell verursachte Belastung der Tiere. Der Vergleich von drei Versuchsgruppen (Kindling-Gruppe, elektrodenimplantierte Kontrollgruppe, naive Kontrollgruppe) während der Phasen der fokalen und generalisierten Anfälle ermöglichte hierbei sowohl eine Aussage über die Belastung durch die fokalen und generalisierten Anfälle als auch durch die gesamte Versuchsprozedur. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnte ein signifikanter Einfluss der Elektrodenimplantation auf das angstassoziierte Verhalten sowie die lokomotorische Aktivität der Tiere beobachtet werden. Die fokalen Anfälle führten in der vorliegenden Studie weder zu Unterschieden hinsichtlich der Verhaltensweisen noch der biochemischen und physiologischen Parameter. In der Phase der generalisierten Anfälle zeigten sich Änderungen des Nestbauverhaltens, der Nestverschmutzung und des angstassoziierten Verhaltens. Des Weiteren konnten in dieser Phase eine erhöhte lokomotorische Aktivität und Herzfrequenz der Tiere in ihrer Ruhephase nachgewiesen werden. Die Analyse der biochemischen Parameter ergab eine erniedrigte Konzentration an Corticosteron im Serum als Konsequenz der Elektrodenimplantation und der wiederholten generalisierten Anfälle. Alle weiteren Parameter der Verhaltensanalysen sowie die biochemischen und physiologischen Parameter ergaben keine Hinweise auf einen Einfluss der generalisierten Anfälle auf das Wohlbefinden der Tiere. Zusätzlich wurden eine Korrelationsmatrixanalyse und eine Hauptkomponentenanalyse durchgeführt, um geeignete Parameter für eine Belastungseinschätzung identifizieren und die Tiergruppen parameterübergreifend vergleichen zu können. Die Korrelationsmatrixanalyse zeigte, dass die Beurteilung des Nestbauverhaltens im Amygdala-Kindling-Modell dazu geeignet ist, bei der Belastungseinstufung aufwendigere Verhaltensuntersuchungen zu ersetzen. Aus der vorliegenden Studie lassen sich somit geeignete Parameter für eine modellspezifische Belastungsbeurteilung in der Routineüberwachung ableiten. Die Hauptkomponentenanalyse zeigte signifikante Unterschiede zwischen der naiven Kontrollgruppe und den beiden anderen Versuchsgruppen (elektrodenimplantierte Kontrollgruppe und Kindling-Gruppe) auf. Die beiden letzteren Gruppen unterschieden sich nicht voneinander. Aufgrund der beschriebenen Auswirkungen auf Verhaltensparameter, lokomotorische Aktivität und Herzfrequenz wird das Amygdala-Kindling-Modell als Tiermodell mit einer mittleren Belastung für die Versuchstiere vorgeschlagen. Die Studie soll dazu beitragen, geeignete Scoring-Systeme für die evidenzbasierte Belastungseinstufung zu entwickeln. Des Weiteren kann die Forschungsgemeinschaft auf die Relevanz der aktiven Umsetzung des 3R-Konzepts aufmerksam gemacht werden. Mit Hilfe der etablierten Methoden soll nachfolgend die in anderen Epilepsiemodellen auftretende Belastung eingestuft werden. Durch die Auswahl des mit dem Forschungsziel zu vereinbarenden Modells mit der jeweils geringstmöglichen Belastung für die Versuchstiere bieten sich Möglichkeiten zum Refinement in der Epilepsieforschung. Zudem werden in der vorliegenden Studie Möglichkeiten zu einem modellspezifischen Refinement aufgezeigt. Auf diese Weise soll zukünftig eine möglichst geringe Belastung der Versuchstiere in Epilepsiemodellen implementiert werden. Im Rahmen der nationalen Forschergruppe werden die Belastungen in Tiermodellen aus vielfältigen Forschungsbereichen miteinander verglichen. Auf diese Weise wird eine Belastungseinschätzung im Sinne der rechtlichen Vorgaben ermöglicht, die nachfolgend in der Routineüberwachung in allen Tierversuchseinrichtungen zur Anwendung kommen kann. Dadurch wird sowohl das Tierwohl als auch die präklinische Datenqualität gesichert., Evidence-based severity assessment in epilepsy models: Investigations in the amygdala kindling model in rats Epilepsies are one of the most common chronic neurological diseases in dogs and cats. Furthermore, around 65 million people worldwide are affected by epilepsies. In veterinary and human medicine, seizures are not medically controlled in about 30 % of patients. Therefore, it is essential to identify new target regions for antiepileptic drugs. Our understanding of the pathophysiological mechanisms of epilepsies and the discovery of the previous three generations of antiepileptic drugs is mainly based on knowledge gained through animal experimentation. In addition to the experimental animals in epilepsy models, experimental animals in many other research areas can exhibit seizure activity. To justify the use of experimental animals according to the legal regulations, a harm-benefit analysis weighing the potential benefits with the expected harm to the animal is required. Additionally, the burden of the animals affects the preclinical data quality. Therefore, evidence-based severity assessment schemes should be used to analyse the actual harm of the experimental animals. This should provide a basis for decisions by authorities and research groups. As part of a national research consortium focused on evidence-based severity assessment in different disease models, this study set out to explore the impact of repeated seizures and procedures on the well-being of the experimental animals. Comprehensive information was obtained about the overall pattern of neurobehavioral, biochemical and physiological alterations associated with the amygdala kindling model of epilepsy. For this purpose, various behavioural investigations were carried out, including the analysis of home cage behaviour, social interaction, burrowing behaviour, and behaviour associated with anxiety and depression. Furthermore, biochemical stress parameters in serum, faeces and hair samples were analysed. For the recording of home cage activity and heart rate a telemetry transmitter was implanted. Various parameters were assessed during the phases of focal and generalised seizures and within different experimental groups. Thereby data about the impact of electrode-implantation and repeated induced seizures in different experimental phases were obtained. Electrode-implantation exerted effects on anxiety-associated behaviour and increased locomotor activity levels two weeks following surgery. Analysis in kindled rats excluded any relevant impact of focal seizures on behavioural, biochemical and physiological parameters. Assessment in rats with generalised seizures revealed an impact on nest complexity, nest soiling and anxiety-associated behaviour. Additionally, an impact of generalised seizures on locomotor activity and heart rate became evident during the resting phase of the animals. Analysis of biochemical parameters revealed a lowered serum corticosterone concentration because of electrode-implantation and repeated seizures. In contrast other parameters of the behavioural, biochemical analysis as well as heart rate variability remained unaffected as a consequence of generalised seizures. In addition, a correlation matrix analysis and a principal component analysis were performed to identify suitable parameters for severity assessment and to compare the experimental groups. Cross-correlation matrix suggested the scoring of nest complexity and nest maintenance as valuable parameter for severity assessment in the amygdala kindling model, which could replace more elaborate behavioural analyses in the future. Principal component analysis revealed significant differences between the naive control group and the other two experimental groups (electrode-implanted control group and Kindling group). The latter two groups did not differ from each other. Overall the findings argue against a persistent level of distress and suggest a classification of the amygdala kindling model as a model with moderate severity based on longer-lasting mild impact on behavioural patterns as well as activity and heart rate in the resting phase. In conclusion, the present study provides information about suitable parameters for a model-specific stress assessment in routine monitoring. Additionally, evidence-based severity assessment schemes can be developed based on this study, which should help to implement the 3R concept in epilepsy research. The choice of a model with the lowest severity offers possibilities for refinement in epilepsy research in terms of the legal regulations. Data from the national research consortium is intended to compare the burden in animal models from various research fields. This ensures animal welfare as well as preclinical data quality.
Not available
Möller, Christina
2018
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Möller, Christina (2018): Evidenzbasierte Belastungseinstufung von Epilepsiemodellen: Untersuchungen im Amygdala-Kindling-Modell bei Ratten. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Epilepsien stellen sowohl in der Veterinär- als auch in der Humanmedizin eine der häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen weltweit dar. In beiden Fällen lassen sich die Anfälle bei etwa 30 % der Patienten nicht medikamentös kontrollieren. Daher ist es essentiell neue Angriffsstrukturen für Antiepileptika zu identifizieren. Das hierfür notwendige Verständnis der pathophysiologischen Hintergründe von Epilepsien und die Entwicklung der bisherigen drei Generationen von Antiepileptika basiert hauptsächlich auf der Durchführung von Tierversuchen. Zusätzlich zu den Versuchstieren, die in der Epilepsieforschung eingesetzt werden, treten auch bei Versuchstieren in vielen anderen Forschungsbereichen Anfälle auf. In welchem Ausmaß die versuchsbedingten Prozeduren sowie die Anfälle selbst eine Belastung für die Tiere darstellen, ist bisher nicht geklärt. In der europäischen Union ist in der Richtlinie 2010/63/EU gesetzlich festgehalten, dass der Nutzen jedes Tierversuchs die den Tieren zugefügten Schmerzen, Leiden und Schäden übersteigen muss. Der auf die Versuchstiere einwirkende Stress beeinflusst zudem die Qualität der erhobenen Daten. Eine evidenzbasierte Belastungseinstufung von Epilepsiemodellen und den dabei auftretenden epileptischen Anfällen ist daher als Grundlage für die Entscheidungen von Behörden und Forschergruppen im Rahmen der Durchführung von Tierversuchen dringend notwendig. Als Teilprojekt einer nationalen Forschungsgemeinschaft, deren Fokus auf der evidenzbasierten Belastungseinstufung liegt, wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von wiederholten epileptischen Anfällen auf das Wohlbefinden von Ratten untersucht. Hierfür wurden verschiedene Verhaltensuntersuchungen durchgeführt, um das Heimkäfigverhalten, das Sozialverhalten, das Grabverhalten und das angst- und depressionsassoziierte Verhalten der Tiere zu untersuchen. Des Weiteren wurden biochemische Stressparameter in Serum-, Kot- und Haarproben evaluiert und mit Hilfe implantierter Telemetrie-Transmitter die lokomotorische Aktivität sowie die Herzfrequenz der Tiere erfasst. Dadurch konnten umfassende Informationen über die Verhaltensänderungen sowie die Änderungen biochemischer und physiologischer Parameter im Amygdala-Kindling-Modell erhoben werden. Diese Daten ermöglichen Rückschlüsse auf eine durch das Modell verursachte Belastung der Tiere. Der Vergleich von drei Versuchsgruppen (Kindling-Gruppe, elektrodenimplantierte Kontrollgruppe, naive Kontrollgruppe) während der Phasen der fokalen und generalisierten Anfälle ermöglichte hierbei sowohl eine Aussage über die Belastung durch die fokalen und generalisierten Anfälle als auch durch die gesamte Versuchsprozedur. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnte ein signifikanter Einfluss der Elektrodenimplantation auf das angstassoziierte Verhalten sowie die lokomotorische Aktivität der Tiere beobachtet werden. Die fokalen Anfälle führten in der vorliegenden Studie weder zu Unterschieden hinsichtlich der Verhaltensweisen noch der biochemischen und physiologischen Parameter. In der Phase der generalisierten Anfälle zeigten sich Änderungen des Nestbauverhaltens, der Nestverschmutzung und des angstassoziierten Verhaltens. Des Weiteren konnten in dieser Phase eine erhöhte lokomotorische Aktivität und Herzfrequenz der Tiere in ihrer Ruhephase nachgewiesen werden. Die Analyse der biochemischen Parameter ergab eine erniedrigte Konzentration an Corticosteron im Serum als Konsequenz der Elektrodenimplantation und der wiederholten generalisierten Anfälle. Alle weiteren Parameter der Verhaltensanalysen sowie die biochemischen und physiologischen Parameter ergaben keine Hinweise auf einen Einfluss der generalisierten Anfälle auf das Wohlbefinden der Tiere. Zusätzlich wurden eine Korrelationsmatrixanalyse und eine Hauptkomponentenanalyse durchgeführt, um geeignete Parameter für eine Belastungseinschätzung identifizieren und die Tiergruppen parameterübergreifend vergleichen zu können. Die Korrelationsmatrixanalyse zeigte, dass die Beurteilung des Nestbauverhaltens im Amygdala-Kindling-Modell dazu geeignet ist, bei der Belastungseinstufung aufwendigere Verhaltensuntersuchungen zu ersetzen. Aus der vorliegenden Studie lassen sich somit geeignete Parameter für eine modellspezifische Belastungsbeurteilung in der Routineüberwachung ableiten. Die Hauptkomponentenanalyse zeigte signifikante Unterschiede zwischen der naiven Kontrollgruppe und den beiden anderen Versuchsgruppen (elektrodenimplantierte Kontrollgruppe und Kindling-Gruppe) auf. Die beiden letzteren Gruppen unterschieden sich nicht voneinander. Aufgrund der beschriebenen Auswirkungen auf Verhaltensparameter, lokomotorische Aktivität und Herzfrequenz wird das Amygdala-Kindling-Modell als Tiermodell mit einer mittleren Belastung für die Versuchstiere vorgeschlagen. Die Studie soll dazu beitragen, geeignete Scoring-Systeme für die evidenzbasierte Belastungseinstufung zu entwickeln. Des Weiteren kann die Forschungsgemeinschaft auf die Relevanz der aktiven Umsetzung des 3R-Konzepts aufmerksam gemacht werden. Mit Hilfe der etablierten Methoden soll nachfolgend die in anderen Epilepsiemodellen auftretende Belastung eingestuft werden. Durch die Auswahl des mit dem Forschungsziel zu vereinbarenden Modells mit der jeweils geringstmöglichen Belastung für die Versuchstiere bieten sich Möglichkeiten zum Refinement in der Epilepsieforschung. Zudem werden in der vorliegenden Studie Möglichkeiten zu einem modellspezifischen Refinement aufgezeigt. Auf diese Weise soll zukünftig eine möglichst geringe Belastung der Versuchstiere in Epilepsiemodellen implementiert werden. Im Rahmen der nationalen Forschergruppe werden die Belastungen in Tiermodellen aus vielfältigen Forschungsbereichen miteinander verglichen. Auf diese Weise wird eine Belastungseinschätzung im Sinne der rechtlichen Vorgaben ermöglicht, die nachfolgend in der Routineüberwachung in allen Tierversuchseinrichtungen zur Anwendung kommen kann. Dadurch wird sowohl das Tierwohl als auch die präklinische Datenqualität gesichert.

Abstract

Evidence-based severity assessment in epilepsy models: Investigations in the amygdala kindling model in rats Epilepsies are one of the most common chronic neurological diseases in dogs and cats. Furthermore, around 65 million people worldwide are affected by epilepsies. In veterinary and human medicine, seizures are not medically controlled in about 30 % of patients. Therefore, it is essential to identify new target regions for antiepileptic drugs. Our understanding of the pathophysiological mechanisms of epilepsies and the discovery of the previous three generations of antiepileptic drugs is mainly based on knowledge gained through animal experimentation. In addition to the experimental animals in epilepsy models, experimental animals in many other research areas can exhibit seizure activity. To justify the use of experimental animals according to the legal regulations, a harm-benefit analysis weighing the potential benefits with the expected harm to the animal is required. Additionally, the burden of the animals affects the preclinical data quality. Therefore, evidence-based severity assessment schemes should be used to analyse the actual harm of the experimental animals. This should provide a basis for decisions by authorities and research groups. As part of a national research consortium focused on evidence-based severity assessment in different disease models, this study set out to explore the impact of repeated seizures and procedures on the well-being of the experimental animals. Comprehensive information was obtained about the overall pattern of neurobehavioral, biochemical and physiological alterations associated with the amygdala kindling model of epilepsy. For this purpose, various behavioural investigations were carried out, including the analysis of home cage behaviour, social interaction, burrowing behaviour, and behaviour associated with anxiety and depression. Furthermore, biochemical stress parameters in serum, faeces and hair samples were analysed. For the recording of home cage activity and heart rate a telemetry transmitter was implanted. Various parameters were assessed during the phases of focal and generalised seizures and within different experimental groups. Thereby data about the impact of electrode-implantation and repeated induced seizures in different experimental phases were obtained. Electrode-implantation exerted effects on anxiety-associated behaviour and increased locomotor activity levels two weeks following surgery. Analysis in kindled rats excluded any relevant impact of focal seizures on behavioural, biochemical and physiological parameters. Assessment in rats with generalised seizures revealed an impact on nest complexity, nest soiling and anxiety-associated behaviour. Additionally, an impact of generalised seizures on locomotor activity and heart rate became evident during the resting phase of the animals. Analysis of biochemical parameters revealed a lowered serum corticosterone concentration because of electrode-implantation and repeated seizures. In contrast other parameters of the behavioural, biochemical analysis as well as heart rate variability remained unaffected as a consequence of generalised seizures. In addition, a correlation matrix analysis and a principal component analysis were performed to identify suitable parameters for severity assessment and to compare the experimental groups. Cross-correlation matrix suggested the scoring of nest complexity and nest maintenance as valuable parameter for severity assessment in the amygdala kindling model, which could replace more elaborate behavioural analyses in the future. Principal component analysis revealed significant differences between the naive control group and the other two experimental groups (electrode-implanted control group and Kindling group). The latter two groups did not differ from each other. Overall the findings argue against a persistent level of distress and suggest a classification of the amygdala kindling model as a model with moderate severity based on longer-lasting mild impact on behavioural patterns as well as activity and heart rate in the resting phase. In conclusion, the present study provides information about suitable parameters for a model-specific stress assessment in routine monitoring. Additionally, evidence-based severity assessment schemes can be developed based on this study, which should help to implement the 3R concept in epilepsy research. The choice of a model with the lowest severity offers possibilities for refinement in epilepsy research in terms of the legal regulations. Data from the national research consortium is intended to compare the burden in animal models from various research fields. This ensures animal welfare as well as preclinical data quality.