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Charakterisierung von TNF-α beim Huhn
Charakterisierung von TNF-α beim Huhn
Bereits Ende des 19. Jahrhunderts wurde die Wirkung des TNF-α als erstes Zytokin beschrieben und ist bis heute eines der am besten untersuchten Signalmoleküle im Immunsystem. Inzwischen konnte eine große Familie strukturell ähnlicher Moleküle identifiziert werden, die in ihrer Gesamtheit die TNF-Superfamilie bilden. Trotz seiner wichtigen Funktion in der Regulation des Immunsystems konnte ein homologes Protein beim Huhn bis heute nicht identifiziert werden, obwohl Orthologe bei zahlreichen Säugern, aber auch bei Amphibien und Fischen charakterisiert wurden. Die Verfügbarkeit großer genomischer Datensätze einer Vielzahl von Vogelspezies hat in den letzten Jahren die Identifizierung zahlreicher sogenannter „missing genes“ in Vogelgenomen ermöglicht, darunter wichtiger Zytokine wie Erythropoetin oder Leptin. Unter Verwendung dieser Datensätze und vergleichbarer Methoden ist es in der vorliegenden Arbeit gelungen, die vollständige Sequenz von TNF-α beim Huhn (chTNF-α) und weiteren Vogelarten zu identifizieren und chTNF-α im Weiteren zu charakterisieren. Die Sequenzen des TNF-α des Huhns und fünf weiterer Vogelspezies weisen eine konservierte extrazelluläre TNF-Homologie Domäne auf, welche eine ca. 45 %ige Übereinstimmung mit der Aminosäuresequenz des Zytokins der Säuger zeigt. Neben der Transmembran-Domäne besitzen die aviären TNF-α Orthologe einen verlängerten intrazellulären Abschnitt. Zusätzlich wurden die bereits beim Huhn bekannten Sequenzen der TNF-Rezeptoren (TNFR1, TNFR2) in Bezug auf ihre phylogenetische Verwandtschaft mit Sequenzen anderer Vertebraten untersucht. Um erste Informationen über die Regulation von TNF-α beim Huhn zu erhalten, wurden Expressionsanalysen von chTNF-α mittels qRT-PCR durchgeführt. Hierzu wurden primäre Makrophagen isoliert und mit Lipopolysaccharid (LPS) für unterschiedliche Zeiträume stimuliert. Wie auch für andere Vertebraten beschrieben, wird TNF-α beim Huhn sehr schnell induziert. Eine signifikante Hochregulation der spezifischen mRNA wurde bereits nach zwei Stunden beobachtet. Nahezu identische Kinetiken wurden für die Induktion in Makrophagen beobachtet, die aus Monozyten, der Milz oder aus Knochenmarksvorläuferzellen gewonnen wurden. Die Analyse der chTNF-α Expression in Lymphozyten zeigte eine signifikante Induktion in isolierten CD4+ T-Helferzellen, nicht aber in CD8+ zytotoxischen T-Zellen. Auch die intravenöse Applikation von LPS führte in vivo nach drei Stunden zu einer signifikanten Induktion der TNF-α mRNA in der Milz, nicht aber in der Leber. Um die biologische Aktivität des Zytokins zu analysieren, wurde die vollständige chTNF-α-Sequenz sowohl in einem eukaryotischen (HEK293) als auch einem prokaryotischen Expressionssystem exprimiert. Die biologische Aktivität der rekombinanten Proteine wurde mit Hilfe einer NF-κB-Reporter-Zelllinie (CEC-NF-κB) quantifiziert. ChTNF-α aus beiden Expressionssystemen bewirkte eine starke Induktion des Reporters. Auch ein Konstrukt, welches lediglich die extrazelluläre Domäne des chTNF-α beinhaltete, führte zu einer hoch signifikanten Reporteraktivierung. Zusammenfassend konnte somit die Existenz eines Orthologs von TNF-α beim Huhn und dessen biologische Aktivität nachgewiesen werden. Damit wurde die Grundlage für weitere umfassende Untersuchungen zur funktionellen Relevanz von TNF-α bei inflammatorischen Prozessen beim Huhn und die Nutzung dieses Zytokins als Biomarker gelegt., TNF-α was the first cytokine to be described and early reports date back to the end of the 19th century. To date it is one of the most intensively investigated signaling molecules of the immune system. Over the last 40 years a large family of structurally similar molecules has been identified, providing the entirety of the TNF-superfamily. Despite its important function in the regulation of the immune system, a homologues protein has not yet been identified in the chicken, although orthologues have been characterized in numerous mammals and also in amphibians and fish. The availability of large genomic databases in a variety of avian species has enabled the identification of numerous so-called “missing genes” in the avian genomes. In recent years this has included important cytokines like erythropoietin and leptin. Using these datasets and comparable methods, this study succeeded in indentifying the complete sequence of TNF-α in the chicken and other bird species and characterizing chTNF-α. The sequences of TNF-α of the chicken and five other bird species show a conserved extracellular TNF-homology domain with 45 % amino acid similarity compared to the mammalian cytokines. In addition to the transmembrane domain the avian TNF-α orthologues contain an extended intracellular part. Furthermore, sequences of the TNF receptors (TNFR1, TNFR2) in the chicken already described by others were analysed for their phylogenetic relationship to sequences of other vertebrates. To obtain first information about the regulation of chTNF-α, expression analyses were performed using qRT-PCR. Primary macrophages were isolated and stimulated with lipopolysaccharide (LPS) for different periods of time. As described for other vertebrates, TNF-α is induced rapidly in chicken cells. A significant upregulation of the specific mRNA was already observed after 2 hours. Almost identical kinetics were observed for the induction in macrophages, which were obtained from monocytes, spleen and bone marrow precursor cells. The analysis of the chTNF-α expression in lymphocytes showed a significant induction in isolated CD4+ T-helper cells, but not in CD8+ cytotoxic T-cells. After three hours the intravenous application of LPS also resulted in a significant induction of chTNF-α mRNA in the spleen but not in the liver. To analyse the biological activity of the cytokine, the entire sequence of chTNF-α was expressed both in eukaryotic (HEK293) and prokaryotic expression systems. The biological activity of the recombinant protein was quantified using a NF-κB-reporter-cell line (CEC-NF-κB). chTNF-α derived from both expression systems caused a strong induction of the reporter. A construct, representing the extracellular domain of chTNF-α, also induced a significantly high activation of the reporter. In summary, the existence of an orthologue of TNF-α in the chicken and its biological activity could be demonstrated. This study lays the foundation for further comprehensive investigations of the functional relevance of TNF-α during inflammatory processes in chicken and the use of this cytokine as a biomarker.
Not available
Rohde, Franziska
2018
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Rohde, Franziska (2018): Charakterisierung von TNF-α beim Huhn. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Bereits Ende des 19. Jahrhunderts wurde die Wirkung des TNF-α als erstes Zytokin beschrieben und ist bis heute eines der am besten untersuchten Signalmoleküle im Immunsystem. Inzwischen konnte eine große Familie strukturell ähnlicher Moleküle identifiziert werden, die in ihrer Gesamtheit die TNF-Superfamilie bilden. Trotz seiner wichtigen Funktion in der Regulation des Immunsystems konnte ein homologes Protein beim Huhn bis heute nicht identifiziert werden, obwohl Orthologe bei zahlreichen Säugern, aber auch bei Amphibien und Fischen charakterisiert wurden. Die Verfügbarkeit großer genomischer Datensätze einer Vielzahl von Vogelspezies hat in den letzten Jahren die Identifizierung zahlreicher sogenannter „missing genes“ in Vogelgenomen ermöglicht, darunter wichtiger Zytokine wie Erythropoetin oder Leptin. Unter Verwendung dieser Datensätze und vergleichbarer Methoden ist es in der vorliegenden Arbeit gelungen, die vollständige Sequenz von TNF-α beim Huhn (chTNF-α) und weiteren Vogelarten zu identifizieren und chTNF-α im Weiteren zu charakterisieren. Die Sequenzen des TNF-α des Huhns und fünf weiterer Vogelspezies weisen eine konservierte extrazelluläre TNF-Homologie Domäne auf, welche eine ca. 45 %ige Übereinstimmung mit der Aminosäuresequenz des Zytokins der Säuger zeigt. Neben der Transmembran-Domäne besitzen die aviären TNF-α Orthologe einen verlängerten intrazellulären Abschnitt. Zusätzlich wurden die bereits beim Huhn bekannten Sequenzen der TNF-Rezeptoren (TNFR1, TNFR2) in Bezug auf ihre phylogenetische Verwandtschaft mit Sequenzen anderer Vertebraten untersucht. Um erste Informationen über die Regulation von TNF-α beim Huhn zu erhalten, wurden Expressionsanalysen von chTNF-α mittels qRT-PCR durchgeführt. Hierzu wurden primäre Makrophagen isoliert und mit Lipopolysaccharid (LPS) für unterschiedliche Zeiträume stimuliert. Wie auch für andere Vertebraten beschrieben, wird TNF-α beim Huhn sehr schnell induziert. Eine signifikante Hochregulation der spezifischen mRNA wurde bereits nach zwei Stunden beobachtet. Nahezu identische Kinetiken wurden für die Induktion in Makrophagen beobachtet, die aus Monozyten, der Milz oder aus Knochenmarksvorläuferzellen gewonnen wurden. Die Analyse der chTNF-α Expression in Lymphozyten zeigte eine signifikante Induktion in isolierten CD4+ T-Helferzellen, nicht aber in CD8+ zytotoxischen T-Zellen. Auch die intravenöse Applikation von LPS führte in vivo nach drei Stunden zu einer signifikanten Induktion der TNF-α mRNA in der Milz, nicht aber in der Leber. Um die biologische Aktivität des Zytokins zu analysieren, wurde die vollständige chTNF-α-Sequenz sowohl in einem eukaryotischen (HEK293) als auch einem prokaryotischen Expressionssystem exprimiert. Die biologische Aktivität der rekombinanten Proteine wurde mit Hilfe einer NF-κB-Reporter-Zelllinie (CEC-NF-κB) quantifiziert. ChTNF-α aus beiden Expressionssystemen bewirkte eine starke Induktion des Reporters. Auch ein Konstrukt, welches lediglich die extrazelluläre Domäne des chTNF-α beinhaltete, führte zu einer hoch signifikanten Reporteraktivierung. Zusammenfassend konnte somit die Existenz eines Orthologs von TNF-α beim Huhn und dessen biologische Aktivität nachgewiesen werden. Damit wurde die Grundlage für weitere umfassende Untersuchungen zur funktionellen Relevanz von TNF-α bei inflammatorischen Prozessen beim Huhn und die Nutzung dieses Zytokins als Biomarker gelegt.

Abstract

TNF-α was the first cytokine to be described and early reports date back to the end of the 19th century. To date it is one of the most intensively investigated signaling molecules of the immune system. Over the last 40 years a large family of structurally similar molecules has been identified, providing the entirety of the TNF-superfamily. Despite its important function in the regulation of the immune system, a homologues protein has not yet been identified in the chicken, although orthologues have been characterized in numerous mammals and also in amphibians and fish. The availability of large genomic databases in a variety of avian species has enabled the identification of numerous so-called “missing genes” in the avian genomes. In recent years this has included important cytokines like erythropoietin and leptin. Using these datasets and comparable methods, this study succeeded in indentifying the complete sequence of TNF-α in the chicken and other bird species and characterizing chTNF-α. The sequences of TNF-α of the chicken and five other bird species show a conserved extracellular TNF-homology domain with 45 % amino acid similarity compared to the mammalian cytokines. In addition to the transmembrane domain the avian TNF-α orthologues contain an extended intracellular part. Furthermore, sequences of the TNF receptors (TNFR1, TNFR2) in the chicken already described by others were analysed for their phylogenetic relationship to sequences of other vertebrates. To obtain first information about the regulation of chTNF-α, expression analyses were performed using qRT-PCR. Primary macrophages were isolated and stimulated with lipopolysaccharide (LPS) for different periods of time. As described for other vertebrates, TNF-α is induced rapidly in chicken cells. A significant upregulation of the specific mRNA was already observed after 2 hours. Almost identical kinetics were observed for the induction in macrophages, which were obtained from monocytes, spleen and bone marrow precursor cells. The analysis of the chTNF-α expression in lymphocytes showed a significant induction in isolated CD4+ T-helper cells, but not in CD8+ cytotoxic T-cells. After three hours the intravenous application of LPS also resulted in a significant induction of chTNF-α mRNA in the spleen but not in the liver. To analyse the biological activity of the cytokine, the entire sequence of chTNF-α was expressed both in eukaryotic (HEK293) and prokaryotic expression systems. The biological activity of the recombinant protein was quantified using a NF-κB-reporter-cell line (CEC-NF-κB). chTNF-α derived from both expression systems caused a strong induction of the reporter. A construct, representing the extracellular domain of chTNF-α, also induced a significantly high activation of the reporter. In summary, the existence of an orthologue of TNF-α in the chicken and its biological activity could be demonstrated. This study lays the foundation for further comprehensive investigations of the functional relevance of TNF-α during inflammatory processes in chicken and the use of this cytokine as a biomarker.