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Phenotypic heterogeneity and the biological significance of a pyruvate sensing network in Escherichia coli
Phenotypic heterogeneity and the biological significance of a pyruvate sensing network in Escherichia coli
When facing nutrient limitation, bacterial populations are forced to optimize uptake systems for available substrates in order to adapt and survive. However, the physiological diversity of each individual in a population leads to differential activation of the uptake systems in response to the same environmental condition. Hence, heterogeneous phenotypes can be generated in a clonal population. A way for each bacterial individual to sense nutrient availability and transmit this information from the extra- to the intracellular spaces is via two-component systems (TCSs). Escherichia coli contains 30 TCSs, each composed of one histidine kinase (HK) and at least one response regulator (RR). The HK is responsible for perceiving the extracellular stimulus and the RR consequently mediates the output, generally a regulation of gene expression. BtsS/BtsR and YpdA/YpdB are examples of two TCSs in E. coli. BtsS/BtsR activation leads to the induction of yjiY, whereas YpdA/YpdB activates yhjX expression. yjiY and yhjX code for putative transporters. Both systems are functionally interconnected and are though to form a large signalling network. This thesis focuses on the analysis of the transcriptional activation of yjiY and yhjX at the single-cell level and on the biological significance of the two TCSs. The activation of the target promoters at the single-cell level was found to be heterogeneous and strongly influenced by the available nutrients. To exploit the biological relevance of the two TCSs, wild-type cells were compared to cells of a btsSRypdAB mutant under two metabolically modulated conditions: protein overproduction and persister formation. BtsS/BtsR and YpdA/YpdB network was shown to contribute to a balancing of the physiological state of all cells within a population. YjiY, the putative transport protein resulting from BtsS/BtsR activation, was found to function as a high-affinity and specific pyruvate/H+ symporter. The protein was renamed for BtsT (Bts is an abbreviation of the German name for pyruvate, Brenztraubensäure, and T stands for Transporter). The correlation between the heterogeneous transcriptional activation of btsT and the number of persister cells was explored using microfluidic technology. It was showed that individuals with low btsT transcriptional activation were more prone to form persisters. A relevant biological application of a pyruvate transporter, the resuscitation from the viable but nonculturable (VBNC) state of E. coli was tested in bulk and single-cell assays and revealed that the concominant presence of pyruvate and BtsS/BtsR and YpdA/YpdB network is required for proper resuscitation from this state. For the first time, phenotypes associated to a mutant lacking the BtsS/BtsR and YpdA/YpdB systems were identified, which in general are related to metabolic challenges. This thesis contributes to a better understanding of the biological role of the two TCSs, BtsS/BtsR and YpdA/YpdB of E. coli., Eine Nährstofflimitation zwingt Bakterienpopulationen dazu, ihre Aufnahmesysteme für verfügbare Substrate zu optimieren, um Adaptation und Überleben zu gewährleisten. Die physiologische Diversität einer Population impliziert trotz gleicher Umweltbedingung eine je nach Individuum verschiedene Aktivierung der Aufnahmesysteme. Infolgedessen können sich in einer klonalen Population heterogene Phänotypen entwickeln. Zweikomponentensystem (TCSs) ermöglichen es jedem bakteriellen Individuum, die Nährstoffverfügbarkeit festzustellen und diese Information von dem extra- in den intrazellulären Raum zu übertragen. Escherichia coli besitzt 30 TCSs, jeweils bestehend aus einer Histidinkinase (HK) und mindestens einem Antwortregulator (RR). Die HK ist dafür verantwortlich, den extrazellulären Stimulus wahrzunehmen, während der RR anschließend den Ausgabewert vermittelt, üblicherweise in Form einer Regulation der Genexpression. BtsS/BtsR und YpdA/YpdB sind Beispiele für zwei TCSs in E. coli. Die Aktivierung von BtsS/BtsR führt zur Induktion von yjiY, während YpdA/YpdB die Expression von yhjX aktiviert. YjiY und yhjX kodieren mutmaßliche Transporter. Die beiden Systeme sind funktionell miteinander verbunden und bilden vermutlich ein großes Signalnetzwerk. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Einzelzellanalyse der transkriptionellen Aktivierung von yjiY und yhjX, sowie auf die biologische Signifikanz der beiden TCSs. Auf Einzelzellebende konnte eine heterogene Aktivierung der Zielpromotoren nachgewiesen werden, die stark von den verfügbaren Nährstoffen beeinflussbar ist. Um die biologische Relevanz der beiden TCSs zu untersuchen, wurden Wildtypzellen mit einer btsSRypdAB Mutante unter zwei metabolisch modifizierten Bedingungen verglichen: Proteinüberproduktion und Persistenz. Es konnte gezeigt werden, dass das Netzwerk aus BtsS/BtsR, sowie YpdA/YpdB zum Ausbalancieren des physiologischen Zustandes aller Zellen einer Population beitragen. YjiY, das aus der BtsS/BtsR Aktivierung resultierende, mutmaßliche Transportprotein, funktioniert nachweislich als hochaffiner und spezifischer Pyruvat/H+ Symporter. Dementsprechend wurde das Protein umbenannt in BtsT (Bts: Abkürzung für Brenztraubensäure, T: Transporter). Die Korrelation zwischen heterogener transkriptioneller Aktivierung von btsT und der Anzahl an Persisterzellen wurde mittels Mikrofluidiktechnologie untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Individuen mit niedrigem btsT Expressionslevel tendenziell anfälliger für den Übergang in den Zustand der Persistenz sind. In Gesamt- und Einzelzelltests konnte belegt werden, dass die gleichzeitige Präsenz von Pyruvat und BtsS/BtsR, sowie YpdA/YpdB Netzwerk Voraussetzung ist für eine korrekte Umkehrung des VBNC Zustandes (viable but nonculturable) von E. coli. Damit wurden zum ersten Mal Phänotypen, die gewöhnlich mit metabolisch herausfordernden Bedingungen in Zusammenhang stehen, bei einer Mutante identifiziert, der die BtsS/BtsR und YpdA/YpdB Systeme fehlen. Diese Arbeit trägt zu einem besseren Verständnis der biologischen Rolle der beiden E. coli TCSs BtsS/BtsR und YpdA/YpdB bei.
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Jorge Vilhena, Cláudia Sofia
2018
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Jorge Vilhena, Cláudia Sofia (2018): Phenotypic heterogeneity and the biological significance of a pyruvate sensing network in Escherichia coli. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

When facing nutrient limitation, bacterial populations are forced to optimize uptake systems for available substrates in order to adapt and survive. However, the physiological diversity of each individual in a population leads to differential activation of the uptake systems in response to the same environmental condition. Hence, heterogeneous phenotypes can be generated in a clonal population. A way for each bacterial individual to sense nutrient availability and transmit this information from the extra- to the intracellular spaces is via two-component systems (TCSs). Escherichia coli contains 30 TCSs, each composed of one histidine kinase (HK) and at least one response regulator (RR). The HK is responsible for perceiving the extracellular stimulus and the RR consequently mediates the output, generally a regulation of gene expression. BtsS/BtsR and YpdA/YpdB are examples of two TCSs in E. coli. BtsS/BtsR activation leads to the induction of yjiY, whereas YpdA/YpdB activates yhjX expression. yjiY and yhjX code for putative transporters. Both systems are functionally interconnected and are though to form a large signalling network. This thesis focuses on the analysis of the transcriptional activation of yjiY and yhjX at the single-cell level and on the biological significance of the two TCSs. The activation of the target promoters at the single-cell level was found to be heterogeneous and strongly influenced by the available nutrients. To exploit the biological relevance of the two TCSs, wild-type cells were compared to cells of a btsSRypdAB mutant under two metabolically modulated conditions: protein overproduction and persister formation. BtsS/BtsR and YpdA/YpdB network was shown to contribute to a balancing of the physiological state of all cells within a population. YjiY, the putative transport protein resulting from BtsS/BtsR activation, was found to function as a high-affinity and specific pyruvate/H+ symporter. The protein was renamed for BtsT (Bts is an abbreviation of the German name for pyruvate, Brenztraubensäure, and T stands for Transporter). The correlation between the heterogeneous transcriptional activation of btsT and the number of persister cells was explored using microfluidic technology. It was showed that individuals with low btsT transcriptional activation were more prone to form persisters. A relevant biological application of a pyruvate transporter, the resuscitation from the viable but nonculturable (VBNC) state of E. coli was tested in bulk and single-cell assays and revealed that the concominant presence of pyruvate and BtsS/BtsR and YpdA/YpdB network is required for proper resuscitation from this state. For the first time, phenotypes associated to a mutant lacking the BtsS/BtsR and YpdA/YpdB systems were identified, which in general are related to metabolic challenges. This thesis contributes to a better understanding of the biological role of the two TCSs, BtsS/BtsR and YpdA/YpdB of E. coli.

Abstract

Eine Nährstofflimitation zwingt Bakterienpopulationen dazu, ihre Aufnahmesysteme für verfügbare Substrate zu optimieren, um Adaptation und Überleben zu gewährleisten. Die physiologische Diversität einer Population impliziert trotz gleicher Umweltbedingung eine je nach Individuum verschiedene Aktivierung der Aufnahmesysteme. Infolgedessen können sich in einer klonalen Population heterogene Phänotypen entwickeln. Zweikomponentensystem (TCSs) ermöglichen es jedem bakteriellen Individuum, die Nährstoffverfügbarkeit festzustellen und diese Information von dem extra- in den intrazellulären Raum zu übertragen. Escherichia coli besitzt 30 TCSs, jeweils bestehend aus einer Histidinkinase (HK) und mindestens einem Antwortregulator (RR). Die HK ist dafür verantwortlich, den extrazellulären Stimulus wahrzunehmen, während der RR anschließend den Ausgabewert vermittelt, üblicherweise in Form einer Regulation der Genexpression. BtsS/BtsR und YpdA/YpdB sind Beispiele für zwei TCSs in E. coli. Die Aktivierung von BtsS/BtsR führt zur Induktion von yjiY, während YpdA/YpdB die Expression von yhjX aktiviert. YjiY und yhjX kodieren mutmaßliche Transporter. Die beiden Systeme sind funktionell miteinander verbunden und bilden vermutlich ein großes Signalnetzwerk. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Einzelzellanalyse der transkriptionellen Aktivierung von yjiY und yhjX, sowie auf die biologische Signifikanz der beiden TCSs. Auf Einzelzellebende konnte eine heterogene Aktivierung der Zielpromotoren nachgewiesen werden, die stark von den verfügbaren Nährstoffen beeinflussbar ist. Um die biologische Relevanz der beiden TCSs zu untersuchen, wurden Wildtypzellen mit einer btsSRypdAB Mutante unter zwei metabolisch modifizierten Bedingungen verglichen: Proteinüberproduktion und Persistenz. Es konnte gezeigt werden, dass das Netzwerk aus BtsS/BtsR, sowie YpdA/YpdB zum Ausbalancieren des physiologischen Zustandes aller Zellen einer Population beitragen. YjiY, das aus der BtsS/BtsR Aktivierung resultierende, mutmaßliche Transportprotein, funktioniert nachweislich als hochaffiner und spezifischer Pyruvat/H+ Symporter. Dementsprechend wurde das Protein umbenannt in BtsT (Bts: Abkürzung für Brenztraubensäure, T: Transporter). Die Korrelation zwischen heterogener transkriptioneller Aktivierung von btsT und der Anzahl an Persisterzellen wurde mittels Mikrofluidiktechnologie untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Individuen mit niedrigem btsT Expressionslevel tendenziell anfälliger für den Übergang in den Zustand der Persistenz sind. In Gesamt- und Einzelzelltests konnte belegt werden, dass die gleichzeitige Präsenz von Pyruvat und BtsS/BtsR, sowie YpdA/YpdB Netzwerk Voraussetzung ist für eine korrekte Umkehrung des VBNC Zustandes (viable but nonculturable) von E. coli. Damit wurden zum ersten Mal Phänotypen, die gewöhnlich mit metabolisch herausfordernden Bedingungen in Zusammenhang stehen, bei einer Mutante identifiziert, der die BtsS/BtsR und YpdA/YpdB Systeme fehlen. Diese Arbeit trägt zu einem besseren Verständnis der biologischen Rolle der beiden E. coli TCSs BtsS/BtsR und YpdA/YpdB bei.