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Multiplexed single molecule observation and manipulation of engineered biomolecules
Multiplexed single molecule observation and manipulation of engineered biomolecules
Molecular processes in organisms are often enabled by structural elements resilient to mechanical forces. For instance, the microbial and hierarchical cellulosome protein system comprises enzymes and the receptor-ligand complexes Cohesin-Dockerin (Coh-Doc), that act in concert for the efficient hydrolysis of plant polysaccharides. The Coh-Doc complexes can withstand remarkably high forces to keep host cells and enzymes bound to their substrates in the extreme environmental conditions the microorganisms frequently live in. This work focuses on the investigation of mechanical stability of such biomolecules on the single-molecule level. The highly symmetric binding interface of the Coh-Doc type I complex from Clostridium thermocellum, enables two different binding conformations withcomparable affinity and similar strength. I was able to show that both conformations exist in the wild-type molecules and are occupied under native conditions. I further characterized one of the strongest non-covalent protein complexes known, Coh-Doc type III from Ruminococcus flavefaciens by elucidating the pivotal role of the adjacent xModule domain for the mechanical stabilization of the whole complex and the role of the bimodal rupture force distribution. Such large forces impair accuracy of measured contour length increments in unfolding studies by inducing conformational changes in poly-ethylene glycol (PEG) linkers in aqueous buffer systems. This problemwas solved by introducing elastin-like polypeptides (ELP) as surface tethers. Having a peptide backbone similar to that of unfolded proteins, ELP linkers do not alter accuracy of the single-molecule force spectroscopy (SMFS) assay. To provide high throughput and precise comparability, I worked on a microfluidic platform for the in vitro protein synthesis and immobilization. The Coh-Doc system was hereby integrated as a binding handle for multiplexed measurements of mechanostability. Employing a single AFM probe to measure multiple different molecules facilitates force precision required to shed light onto molecular mechanisms down to the level of single amino acids. I also applied the Coh-Doc complex to a purely protein based single-molecule cut and paste assay for the bottom-up assembly of molecular systems for quick phenotyping of spatial arrangements. With this system, interactions in enzymatic synergies can be studied by defined positioning patterns on the single molecule level. To understand and design force responses of complex systems, I complemented the investigation of protein systems with SMFS studies on DNA Origami structures. The results of SMFS on DNA were compared to a simulation framework. Despite their difference in force loading rates, both methods agree well within their results, enabling better fundamental understanding of complex molecular superstructures., Molekulare Prozesse in Organismenwerden oft von Strukturelementen ermöglicht, die mechanischen Kräften standhalten können. Ein Beispiel hierfür ist das mikrobielle und hierarchisch aufgebaute Proteinsystem des Zellulosoms. Enzyme und die Rezeptor-Liganden Komplexe Cohesin-Dockerin (Coh-Doc) arbeiten hierbei für die effiziente Hydrolyse von pflanzlichen Polysacchariden zusammen. Die Coh-Doc Komplexe können bemerkenswerten Kräften standhalten, um in den extremen Umweltbedingungen, in denen die Mikroorganismen teilweise leben, die Wirtszellen und Enzyme an ihre Substrate binden zu können. Die vorliegende Arbeit untersucht den Einfluss von mechanischer Kraft auf solche Biomoleküle mittels Einzelmolekülmessungen. Die hohe Symmetrie des Bindeinterfaces des Coh-Doc Typ I Komplexes aus Clostridium thermocellum ermöglicht zwei verschiedene Konformationen, die vergleichbare Affinität und Stärke aufweisen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich beide in denWildtyp-Molekülen und unter nativen Bedingungen nachweisen. Eines der stärksten bekannten nicht-kovalenten Rezeptor-Liganden Systeme, Coh- Doc Typ III aus Ruminococcus flavefaciens wurde charakterisiert, und die Kernrolle des benachbarten xModuls für die Stabilität des gesamten Komplexes sowie die Rolle der bimodalen Kraftverteilung untersucht. Solch hohe Kräfte vermindern die Genauigkeit der gemessenenKonturlängeninkremente von Proteinentfaltungen, indem sie Konformationsänderungen der Poly- Ethylenglykol (PEG) Oberflächenanker in wässrigen Puffersystemen verursachen. Mit Elastin-ähnlichen Polypeptiden (ELP) als Anker wurde dieses Problem gelöst: durch die Ähnlichkeit des Peptid-Rückgrates von ELPs mit dem entfaltener Proteine beeinflussen diese die Genauigkeit des Experiments nicht. Für die Optimierung von Messdurchsatz und Vergleichbarkeit entwickelte ich an einer Mikrofluidik-Plattform zur in vitro Proteinsynthese und -immobilisierung. Das Coh-Doc System wurde hierbei als Binde-Molekül für gemultiplexte Messungen integriert. Die dadurch ermöglichte Nutzung einer einzigen AFM Messsonde für die Messung verschiedener Moleküle erlaubt die nötige Kraftpräzision, um molekulare Mechanismen bis auf die Ebene einzelner Aminosäuren aufzuklären. Des weiteren habe ich den Coh-Doc Komplex in einem rein auf Proteininteraktionen basierten ’Cut and Paste’ Assay für den modularen Aufbau molekularer Systeme implementiert. Dieses ermöglicht schnelle Phänotypisierung geometrischer Anordnunungen und die Untersuchung von Wechselwirkung zwischen Enzymen mittels definierter Positionierung auf Einzelmolekülebene. Um die Kraftantwort komplexer Systeme besser verstehen und letztendlich gestalten zu können, ergänzte ich die Untersuchung von Proteinsystemen mit derer von DNA-Origami Strukturen. Die Ergebnisse der Kraftspektroskopie an DNA wurden mit Computersimulationen verglichen, und trotz des großen Unterschieds ihrer Ladungsraten stimmen beide Methoden gut überein. Dadruch legen sie die Grundlagen für ein besseres Verständnis komplexer molekularer Superstrukturen.
Not available
Jobst, Markus A.
2018
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Jobst, Markus A. (2018): Multiplexed single molecule observation and manipulation of engineered biomolecules. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
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Abstract

Molecular processes in organisms are often enabled by structural elements resilient to mechanical forces. For instance, the microbial and hierarchical cellulosome protein system comprises enzymes and the receptor-ligand complexes Cohesin-Dockerin (Coh-Doc), that act in concert for the efficient hydrolysis of plant polysaccharides. The Coh-Doc complexes can withstand remarkably high forces to keep host cells and enzymes bound to their substrates in the extreme environmental conditions the microorganisms frequently live in. This work focuses on the investigation of mechanical stability of such biomolecules on the single-molecule level. The highly symmetric binding interface of the Coh-Doc type I complex from Clostridium thermocellum, enables two different binding conformations withcomparable affinity and similar strength. I was able to show that both conformations exist in the wild-type molecules and are occupied under native conditions. I further characterized one of the strongest non-covalent protein complexes known, Coh-Doc type III from Ruminococcus flavefaciens by elucidating the pivotal role of the adjacent xModule domain for the mechanical stabilization of the whole complex and the role of the bimodal rupture force distribution. Such large forces impair accuracy of measured contour length increments in unfolding studies by inducing conformational changes in poly-ethylene glycol (PEG) linkers in aqueous buffer systems. This problemwas solved by introducing elastin-like polypeptides (ELP) as surface tethers. Having a peptide backbone similar to that of unfolded proteins, ELP linkers do not alter accuracy of the single-molecule force spectroscopy (SMFS) assay. To provide high throughput and precise comparability, I worked on a microfluidic platform for the in vitro protein synthesis and immobilization. The Coh-Doc system was hereby integrated as a binding handle for multiplexed measurements of mechanostability. Employing a single AFM probe to measure multiple different molecules facilitates force precision required to shed light onto molecular mechanisms down to the level of single amino acids. I also applied the Coh-Doc complex to a purely protein based single-molecule cut and paste assay for the bottom-up assembly of molecular systems for quick phenotyping of spatial arrangements. With this system, interactions in enzymatic synergies can be studied by defined positioning patterns on the single molecule level. To understand and design force responses of complex systems, I complemented the investigation of protein systems with SMFS studies on DNA Origami structures. The results of SMFS on DNA were compared to a simulation framework. Despite their difference in force loading rates, both methods agree well within their results, enabling better fundamental understanding of complex molecular superstructures.

Abstract

Molekulare Prozesse in Organismenwerden oft von Strukturelementen ermöglicht, die mechanischen Kräften standhalten können. Ein Beispiel hierfür ist das mikrobielle und hierarchisch aufgebaute Proteinsystem des Zellulosoms. Enzyme und die Rezeptor-Liganden Komplexe Cohesin-Dockerin (Coh-Doc) arbeiten hierbei für die effiziente Hydrolyse von pflanzlichen Polysacchariden zusammen. Die Coh-Doc Komplexe können bemerkenswerten Kräften standhalten, um in den extremen Umweltbedingungen, in denen die Mikroorganismen teilweise leben, die Wirtszellen und Enzyme an ihre Substrate binden zu können. Die vorliegende Arbeit untersucht den Einfluss von mechanischer Kraft auf solche Biomoleküle mittels Einzelmolekülmessungen. Die hohe Symmetrie des Bindeinterfaces des Coh-Doc Typ I Komplexes aus Clostridium thermocellum ermöglicht zwei verschiedene Konformationen, die vergleichbare Affinität und Stärke aufweisen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich beide in denWildtyp-Molekülen und unter nativen Bedingungen nachweisen. Eines der stärksten bekannten nicht-kovalenten Rezeptor-Liganden Systeme, Coh- Doc Typ III aus Ruminococcus flavefaciens wurde charakterisiert, und die Kernrolle des benachbarten xModuls für die Stabilität des gesamten Komplexes sowie die Rolle der bimodalen Kraftverteilung untersucht. Solch hohe Kräfte vermindern die Genauigkeit der gemessenenKonturlängeninkremente von Proteinentfaltungen, indem sie Konformationsänderungen der Poly- Ethylenglykol (PEG) Oberflächenanker in wässrigen Puffersystemen verursachen. Mit Elastin-ähnlichen Polypeptiden (ELP) als Anker wurde dieses Problem gelöst: durch die Ähnlichkeit des Peptid-Rückgrates von ELPs mit dem entfaltener Proteine beeinflussen diese die Genauigkeit des Experiments nicht. Für die Optimierung von Messdurchsatz und Vergleichbarkeit entwickelte ich an einer Mikrofluidik-Plattform zur in vitro Proteinsynthese und -immobilisierung. Das Coh-Doc System wurde hierbei als Binde-Molekül für gemultiplexte Messungen integriert. Die dadurch ermöglichte Nutzung einer einzigen AFM Messsonde für die Messung verschiedener Moleküle erlaubt die nötige Kraftpräzision, um molekulare Mechanismen bis auf die Ebene einzelner Aminosäuren aufzuklären. Des weiteren habe ich den Coh-Doc Komplex in einem rein auf Proteininteraktionen basierten ’Cut and Paste’ Assay für den modularen Aufbau molekularer Systeme implementiert. Dieses ermöglicht schnelle Phänotypisierung geometrischer Anordnunungen und die Untersuchung von Wechselwirkung zwischen Enzymen mittels definierter Positionierung auf Einzelmolekülebene. Um die Kraftantwort komplexer Systeme besser verstehen und letztendlich gestalten zu können, ergänzte ich die Untersuchung von Proteinsystemen mit derer von DNA-Origami Strukturen. Die Ergebnisse der Kraftspektroskopie an DNA wurden mit Computersimulationen verglichen, und trotz des großen Unterschieds ihrer Ladungsraten stimmen beide Methoden gut überein. Dadruch legen sie die Grundlagen für ein besseres Verständnis komplexer molekularer Superstrukturen.