Structural and biochemical studies of the S. cerevisiae DNA/RNA helicase Sen1

Leonaitė-Pittelkov, Bronislava (2018): Structural and biochemical studies of the S. cerevisiae DNA/RNA helicase Sen1. Dissertation, LMU München: Fakultät für Chemie und Pharmazie

Abstract

The RNA polymerase II (Pol II) is known to play a central role in transcribing all protein coding genes and non-coding RNAs (ncRNAs) in eukaryotic cells. Intriguingly, the majority of short ncRNAs are immediately degraded in the nucleus and therefore referred to as cryptic unstable transcripts (CUTs). Studies in S. cerevisiae have revealed that the Nab3-Nrd1-Sen1 (NNS) complex couples the short ncRNA transcription termination and RNA degradation by the nuclear exosome. Sen1 (252 kDa) is a well-conserved 5'→3' RNA helicase and a key player in transcription termination. In order to understand better the mechanism of termination, the helicase core domain of Sen1 (94 kDa) was expressed, purified and crystallized, and the crystal structure was solved. As shown in this work, Sen1 helicase domain has a very similar overall structure to that of Upf1-like helicases. Surprisingly, the structure reveals a unique feature, the “brace”, which fastens the accessory subdomains to RecA1 and frames the helicase in a favorable conformation for RNA binding. Moreover, structure based biochemical studies reveal that the “prong” is an essential element for 5'→3' unwinding and releasing the transcription complex from the template. Finally, I discuss the mechanism of RNA helicase translocation in the 5'→3' direction and propose a structure based model for Pol II elongation complex dissociation.

Abstract

Die RNA Polymerase II (Pol II) spielt bekanntermaßen eine zentrale Rolle in der Transkription aller proteinkodierenden Gene und nicht-kodierender RNAs (ncRNAs, von English: non-coding RNAs) in Eukaryoten. Interessanterweise wird ein Großteil der kleinen ncRNAs noch im Zellkern umgehend abgebaut und deshalb als kryptische instabile Tranksripte (CUTs, von English: cryptic unstable transcripts) bezeichnet. Studien in S. cerevisiae haben gezeigt, dass der Nab3-Nrd1-Sen1 (NNS) Komplex die Transkriptionstermination kleiner ncRNAs mit dem exosomalen RNA Abbau im Zellkern verbindet. Sen1 (252 kDa) ist eine hochkonservierte 5'→3' RNA-Helikase und nimmt eine Schlüsselrolle in der Transkriptionstermination ein. Um den Terminationsmechanismus besser zu verstehen wurde die zentrale Helikasedomäne von Sen1 (94 kDa) exprimiert, aufgereinigt und kristallisiert, sowie deren Kristallstruktur gelöst. Wie in dieser Arbeit beschrieben, besitzt Sen1 eine Helikasedomäne mit einer ähnlichen Gesamtstruktur wie Upf1-artige Helikasen. Überraschenderweise weist die Struktur als einzigartiges Merkmal den sogenannten „brace“ (Deutsch: Klammer) auf, der die zusätzlichen Unterdomänen an RecA1 fixiert und die Helikase in einer günstigen Konformation für die RNA-Bindung hält. Desweiteren zeigen strukturbasierte biochemische Analysen, dass der sogenannte „prong“ (Deutsch: Zinke) eine wichtige Komponente für die 5'→3' Entwindung und die Freisetzung des Transkriptionskomplexes vom Matrizenstrang ist. Abschließend wird der Mechanismus der RNA-Helikasetranslokation in 5'→3' Richtung diskutiert und ein Modell für die Dissoziation des Pol II Elongationskomplexes vorgeschlagen, basierend auf den Proteinstrukturen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Sen1, RNA helicase, transcription termination, crystal structure
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
• Fakultäten: Fakultät für Chemie und Pharmazie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 10. April 2018
• 1. Bericht­erstatter:in: Conti, Elena