Ermittlung der Bindespezifitäten für das canine MHC-Klasse-I-Allel DLA-88*03201 sowie vergleichende Betrachtung viraler und zellulärer Liganden von DLA-88*50101 und HLA-A*02:01

Schreitmüller, Christian (2018): Ermittlung der Bindespezifitäten für das canine MHC-Klasse-I-Allel DLA-88*03201 sowie vergleichende Betrachtung viraler und zellulärer Liganden von DLA-88*50101 und HLA-A*02:01. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät

Abstract

Für die Behandlung von Krebserkrankungen existieren inzwischen, neben den konservativen Methoden, der chirurgischen Intervention, der Radio- und der Chemotherapie, auch eine Reihe alternativer Therapieansätze. Hierzu zählt unter anderem die Immuntherapie mittels Peptidvakzinen, welche sich durch die Injektion von im Voraus bestimmten, tumorassoziierten und tumorspezifischen Peptiden auszeichnet. Infolgedessen kann eine spezifische T-Zell-Immunantwort gegen Tumorzellen ausgelöst werden und der Körper wird somit in die Lage versetzt, entartete Zellen zu erkennen und selbst zu eliminieren. Eine wichtige Voraussetzung für die Etablierung von Peptidvakzinen besteht in der Kenntnis der Bindungsansprüche, die ein MHC-Molekül, je nach MHC-Allel, an seine Peptidliganden stellt. Während in der Humanimmunologie bereits eine Vielzahl an allelspezifischen Bindemotiven definiert werden konnte, ist in der Veterinärimmunologie noch relativ wenig darüber bekannt, wie Peptide auf caninen MHC-Molekülen verankert sind. In dieser Arbeit wurden daher humane C1R- und K562-Zellen mit dem caninen MHC-Klasse-I-Allel DLA-88*03201 transfiziert, die MHC-Moleküle anschließend mittels Immunaffinitäschromatographie selektiert und 289 DLA-assoziierte Liganden mittels massenspektrometrischer Analyse identifiziert. Daraus ergab sich die Möglichkeit, die Bindespezifitäten für das canine MHC-Klasse-I-Allel DLA-88*03201 zu definieren, welche vermutlich durch die Aminosäuren Arginin und Valin an Position 1 sowie die Aminosäuren Phenylalanin und Leucin an Position 9 bestimmt werden. Darüber hinaus konnten C1R-DLA-88*50101-Zellen mit dem Influenza-A-Virus H1N1 Regens-burg/D6/2009 infiziert werden, wodurch nach durchgeführter Immunaffinitätschromatographie und massenspektrometrischer Analyse erstmalig 8 virale DLA-88*50101-Liganden identifiziert werden konnten. Durch den Vergleich zellulärer und viraler HLA-A*02:01- und DLA-88*50101-Liganden konnte in dieser Arbeit dargelegt werden, konform mit bereits existierenden Forschungsergebnissen, dass bei der Auswahl der Peptide, die auf den MHC-Komplexen gebunden werden, in erster Linie wohl nicht die Selektivität des Proteasomes und des TAP-Komplex entscheidend ist, sondern viel eher die Affinität des Peptid bindenden Spalts für spezifische Peptidsequenzen eine Rolle spielt. Daraus folgt die Annahme, dass sich die verwendeten humanen DLA-Transfektanten gut für eine Bestimmung caniner Bindemotive eignen, obwohl deren Antigenprozessierungsmaschinerie von der im Naturzustand in Hundezellen exprimierten abwich. Jedoch wird den endgültigen Nachweis in Zukunft nur der Vergleich des Peptidrepertoires von humanen DLA-Hybridzellen mit dem Peptidrepertoire von caninen Zellen mit dem gleichen DLA-Allel ermöglichen. Das Wissen, das aus den neu identifizierten DLA-Bindungsspezifitäten und Influenzaepitopen resultiert, könnte in Zukunft dazu beitragen, die Immunantwort caniner Zellen sowie die T-Zell-Reaktionen beim Hund im Rahmen von Krebserkrankungen und verschiedener Infektionskrankheiten besser zu verstehen. Davon könnte wiederum nicht nur der Hund profitieren, sondern auch der Mensch, indem möglicherweise auch neue Erkenntnisse für die Humanmedizin gewonnen werden.

Abstract

Besides conservative methods, surgery, radiotherapy and chemotherapy, numerous alternative approaches to cancer treatment are now available. One example is immunotherapy with peptide vaccines, involving the injection of previously determined, tumor-associated and tumor-specific peptides. A specific T-cell immune response against tumor cells can thus be induced, enabling the body to recognize and eliminate mutated cells. To develop peptide vaccines, it is important to be aware of the binding requirements an MHC molecule places on its peptide ligands depending on the MHC allele. Whereas in human immunology a vast number of allele-specific binding motifs have already been defined, relatively little is known about the way peptides are bound to canine MHC molecules. Hence, for the purposes of this thesis, human C1R and K562 cells were transfected with the canine MHC class I DLA-88*03201 allele. The MHC molecules were then selected using immunoaffinity chromatography, and 289 DLA-associated ligands identified by mass spectrometric analysis. It was therefore possible to define the binding specificities for the canine MHC class I DLA-88*03201 allele that are presumably determined by the amino acids arginine and valine at position 1, and phenylalanine and leucine at position 9. In addition, C1R-DLA-88*50101 cells were infected with influenza virus A/Regensburg/D6/2009(H1N1), whereupon eight viral DLA-88*50101 peptides were identified for the first time by means of immunoaffinity chromatography and mass spectrometric analysis. Comparison of cellular and viral HLA-A*02:01 and DLA-88*50101 ligands revealed, in line with previously published research, that the selection of peptides bound to the MHC complexes depends much less on the selectivity of the proteasome and the TAP complex and far more on the affinity of the peptide-binding groove for specific peptide sequences. As a result, it can be assumed that the employed human DLA transfectants work well for the characterization of canine binding motifs, although their antigen processing machinery differs from that expressed in the natural state in canine cells. However, this can only be verified in the future by comparing the peptide repertoire of human DLA hybrid cells with the repertoire of canine cells that have the same DLA allele. The knowledge gained from the newly determined DLA binding specificities and influenza virus epitopes will most likely help in better understanding the canine cell immune responses and canine T-cell reactions within the context of cancer and various infectious diseases. This could, in turn, not only benefit dogs but possibly offer new opportunities in human medicine.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 590 Tiere (Zoologie)
• Fakultäten: Tierärztliche Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 10. Februar 2018
• 1. Bericht­erstatter:in: Hirschberger, Johannes