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Einfluss der Biofilmbildung sowie pathogener und probiotischer Bakterien auf die Virulenz von Cronobacter sakazakii
Einfluss der Biofilmbildung sowie pathogener und probiotischer Bakterien auf die Virulenz von Cronobacter sakazakii
Cronobacter sakazakii ist ein Gram-negatives Bakterium, das durch sein Vorkommen in pulverförmiger Säuglingsnahrung (PIF) schwerwiegende Erkrankungen beim Neugeborenen auslösen kann. Die Fähigkeit zur Biofilmbildung erhöht die Resistenz des Pathogens gegenüber äußeren Umwelteinflüssen und stellt somit ein großes Problem für die Lebensmittelindustrie dar, da Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen eine Kontamination mit C. sakazakii häufig nicht verhindern können. Zwar besteht für Cronobacter spp. eine Korrelation zwischen der Biofilmbildung und der Persistenz außerhalb des Wirts, jedoch konnte bisher noch keine Verbindung zu seiner Virulenz festgestellt werden. Aus diesem Grund wurden insgesamt 20 C. sakazakii-Stämme unterschiedlicher Herkunft hinsichtlich ihrer Biofilmbildung unter verschiedenen Bedingungen phänotypisch charakterisiert. Basierend auf den unterschiedlichen phänotypischen Biofilmeigenschaften wurden drei C. sakazakii-Stämme ausgewählt, ihre Biofilmbildung quantifiziert, biochemisch analysiert und ihre Virulenz im Zellkulturmodell untersucht. Um Hinweise über die Mechanismen während der Biofilmbildung zu erhalten, wurden die Untersuchungen gleichzeitig mit den wzx-Mutanten derselben Stämme durchgeführt, die kein LPS mehr produzierten. Bei der phänotypischen Charakterisierung der Biofilmbildung konnte festgestellt werden, dass die Fähigkeit zur Biofilmbildung innerhalb der Spezies C. sakazakii stark variiert und von Umweltfaktoren wie der Temperatur, dem Nährstoffangebot und der Oberflächenstruktur beeinflusst wird. Die Biofilmbildung war bei Umweltisolaten deutlich ausgeprägter als bei klinischen Isolaten, was die Bedeutung des Biofilms für das Überleben der Bakterien in der Umwelt bestätigt. Die biochemische Analyse der extrazellulären, polysaccharidhaltigen Biofilmmatrix ergab einen hohen Anteil an sezernierten Exopolysacchariden (EPS), wobei mittels Auftrennung in zellgebundene und extrazelluläre EPS der Nachweis einer Kapsel gelang. Zudem konnte die Produktion von Zellulose als Bestandteil der Biofilmmatrix identifiziert werden. Das Ergebnis der Infektionsversuche ergab, dass die Bakterienzellen aus dem Biofilm (Aggregate) im Vergleich zu den planktonischen Zellen in ihrer Invasivität attenuiert waren. In diesem Zusammenhang konnte auch festgestellt werden, dass Aggregatzellen unter dem Stressfaktor Austrocknung früher in den VBNC-Zustand übergehen als die planktonischen Zellen, jedoch ihre Invasivität nach dem Reaktivierungsprozess im Gegensatz zu den planktonischen Zellen vermindert war. Weiterhin wurde Katalase als Faktor identifiziert, der die Reaktivierung der VBNC-Zellen in den kultivierbaren Zustand induziert. Da das Enzym von eukaryotischen Zellen sezerniert wird, kommt es sowohl in der Milch als auch im Magen-Darm-Trakt vor, sodass die Reaktivierung bereits während der Rekonstitution in der Milch oder nach Verabreichung der Nahrung im Verdauungstrakt des Neugeborenen induziert und eine Infektion begünstigt wird. Weiterhin wurde in dieser Arbeit der Einfluss pathogener und probiotischer Bakterien auf das Wachstum und die Virulenz von C. sakazakii untersucht. Im Zellkulturmodell zeigte sich, dass die Ko-Infektion mit B. cereus bzw. L. monocytogenes die Invasion von C. sakazakii ES 5 begünstigte, wohingegen die Ko-Infektion mit probiotischen Mikroorganismen einen gegenteiligen Effekt erzielte und die eukaryotischen Epithelzellen vor dem Eindringen des Pathogens schützte. Anhand weiterführender Untersuchungen wurde in dieser Arbeit festgestellt, dass die Sekretion antimikrobieller Substanzen sowie die Absenkung des pH-Wertes durch probiotische Laktobazillen die Invasivität von C. sakazakii hemmte. Zusätzlich gelang in dieser Arbeit die Etablierung möglicher Ansätze für einen wirksamen und sicheren Einsatz von Probiotika in PIF, da der Zusatz steriler Überstände von probiotischen Lactobacillus-Kulturen zu verschiedener Säuglingsnahrung, wie Anfangsmilch, Folgemilch und Brei einen inhibitorischen Effekt auf das Wachstum von C. sakazakii ES 5 erzielte., Cronobacter sakazakii is a gram-negative bacterium that can cause severe neonatal diseases due to its occurence in powdered infant formula (PIF). The ability to form biofilm increases the resistance of the pathogen to external environmental influences and poses therefore a major problem for the food industry, since cleaning and disinfecting measures often cannot prevent the contamination with C. sakazakii. For Cronobacter spp. a correlation between biofilm formation and persistence outside the host has already been reported, however, no connection to its virulence has yet been established. For this reason a total of 20 C. sakazakii strains of different sources were phenotypically characterized in their biofilm formation under various conditions. Based on the different phenotypic biofilm characteristics, three C. sakazakii strains were selected, their biofilm formation quantified, biochemically analyzed and their virulence examined performing a gentamicin protection assay. To obtain information on the mechanisms during biofilm formation, the studies were carried out simultaneously with the wzx-mutants of the same strains that did not produce LPS. In the phenotypic biofilm characterization it was found that the ability to form biofilm within the species C. sakazakii varies widely and is influenced by environmental factors such as temperature, nutrient supply and surface structure. Biofilm formation was much more pronounced in environmental isolates than in clinical isolates, which confirms the importance of biofilm for the survival of the bacteria in the environment. The biochemical analysis of the extracellular polysaccharide-containing biofilm matrix revealed a high amount of secreted exopolysaccharides (EPS), whereby the detection of a capsule was achieved by separation into cell-bound and extracellular EPS. In addition the production of cellulose as a component of the biofilm matrix was identified. The result of the gentamicin protection assay showed that the bacterial cells from the biofilm (aggregates) were attenuated in their invasivity compared to the planktonic cells. In this context it was also found that aggregates under the stress factor dehydration earlier enter into the VBNC state than the planktonic cells, but their invasiveness after resuscitation was reduced in contrast to the planktonic cells. Furthermore catalase was identified as a factor which induces the resuscitation of the VBNC state into the culturable state. Since this enzyme is secreted by eukaryotic cells, it occurs both in the milk and in the gastrointestinal tract, so that the resuscitation is already induced during the reconstitution of PIF or after its administration in the digestive tract of the newborn so that an infection is facilitated. Furthermore the influence of pathogenic and probiotic bacteria on the growth and virulence of C. sakazakii was investigated in this study. Performing a gentamicin protection assay it was shown that the co-infection with B. cereus and L. monocytogenes facilitated the invasion of C. sakazakii ES 5, whereas the co-infection with probiotic microorganisms produced a contrary effect and protected the eukaryotic epithelial cells from the penetration of the pathogen. On the basis of further studies, it was found in this work that the secretion of antimicrobial substances and the lowering of the pH value by probiotic Lactobacillus inhibited the invasiveness of C. sakazakii. Additionally the establishment of possible approaches for the effective and safe use of probiotics in PIF was achieved, since the addition of sterile supernatants from probiotic Lactobacillus cultures to different infant nutrition such as initial milk, follow up formula and plant-based baby food (mash) has an inhibitory effect on the growth of C. sakazakii ES 5.
Not available
Stecklum, Joyce
2018
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Stecklum, Joyce (2018): Einfluss der Biofilmbildung sowie pathogener und probiotischer Bakterien auf die Virulenz von Cronobacter sakazakii. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Cronobacter sakazakii ist ein Gram-negatives Bakterium, das durch sein Vorkommen in pulverförmiger Säuglingsnahrung (PIF) schwerwiegende Erkrankungen beim Neugeborenen auslösen kann. Die Fähigkeit zur Biofilmbildung erhöht die Resistenz des Pathogens gegenüber äußeren Umwelteinflüssen und stellt somit ein großes Problem für die Lebensmittelindustrie dar, da Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen eine Kontamination mit C. sakazakii häufig nicht verhindern können. Zwar besteht für Cronobacter spp. eine Korrelation zwischen der Biofilmbildung und der Persistenz außerhalb des Wirts, jedoch konnte bisher noch keine Verbindung zu seiner Virulenz festgestellt werden. Aus diesem Grund wurden insgesamt 20 C. sakazakii-Stämme unterschiedlicher Herkunft hinsichtlich ihrer Biofilmbildung unter verschiedenen Bedingungen phänotypisch charakterisiert. Basierend auf den unterschiedlichen phänotypischen Biofilmeigenschaften wurden drei C. sakazakii-Stämme ausgewählt, ihre Biofilmbildung quantifiziert, biochemisch analysiert und ihre Virulenz im Zellkulturmodell untersucht. Um Hinweise über die Mechanismen während der Biofilmbildung zu erhalten, wurden die Untersuchungen gleichzeitig mit den wzx-Mutanten derselben Stämme durchgeführt, die kein LPS mehr produzierten. Bei der phänotypischen Charakterisierung der Biofilmbildung konnte festgestellt werden, dass die Fähigkeit zur Biofilmbildung innerhalb der Spezies C. sakazakii stark variiert und von Umweltfaktoren wie der Temperatur, dem Nährstoffangebot und der Oberflächenstruktur beeinflusst wird. Die Biofilmbildung war bei Umweltisolaten deutlich ausgeprägter als bei klinischen Isolaten, was die Bedeutung des Biofilms für das Überleben der Bakterien in der Umwelt bestätigt. Die biochemische Analyse der extrazellulären, polysaccharidhaltigen Biofilmmatrix ergab einen hohen Anteil an sezernierten Exopolysacchariden (EPS), wobei mittels Auftrennung in zellgebundene und extrazelluläre EPS der Nachweis einer Kapsel gelang. Zudem konnte die Produktion von Zellulose als Bestandteil der Biofilmmatrix identifiziert werden. Das Ergebnis der Infektionsversuche ergab, dass die Bakterienzellen aus dem Biofilm (Aggregate) im Vergleich zu den planktonischen Zellen in ihrer Invasivität attenuiert waren. In diesem Zusammenhang konnte auch festgestellt werden, dass Aggregatzellen unter dem Stressfaktor Austrocknung früher in den VBNC-Zustand übergehen als die planktonischen Zellen, jedoch ihre Invasivität nach dem Reaktivierungsprozess im Gegensatz zu den planktonischen Zellen vermindert war. Weiterhin wurde Katalase als Faktor identifiziert, der die Reaktivierung der VBNC-Zellen in den kultivierbaren Zustand induziert. Da das Enzym von eukaryotischen Zellen sezerniert wird, kommt es sowohl in der Milch als auch im Magen-Darm-Trakt vor, sodass die Reaktivierung bereits während der Rekonstitution in der Milch oder nach Verabreichung der Nahrung im Verdauungstrakt des Neugeborenen induziert und eine Infektion begünstigt wird. Weiterhin wurde in dieser Arbeit der Einfluss pathogener und probiotischer Bakterien auf das Wachstum und die Virulenz von C. sakazakii untersucht. Im Zellkulturmodell zeigte sich, dass die Ko-Infektion mit B. cereus bzw. L. monocytogenes die Invasion von C. sakazakii ES 5 begünstigte, wohingegen die Ko-Infektion mit probiotischen Mikroorganismen einen gegenteiligen Effekt erzielte und die eukaryotischen Epithelzellen vor dem Eindringen des Pathogens schützte. Anhand weiterführender Untersuchungen wurde in dieser Arbeit festgestellt, dass die Sekretion antimikrobieller Substanzen sowie die Absenkung des pH-Wertes durch probiotische Laktobazillen die Invasivität von C. sakazakii hemmte. Zusätzlich gelang in dieser Arbeit die Etablierung möglicher Ansätze für einen wirksamen und sicheren Einsatz von Probiotika in PIF, da der Zusatz steriler Überstände von probiotischen Lactobacillus-Kulturen zu verschiedener Säuglingsnahrung, wie Anfangsmilch, Folgemilch und Brei einen inhibitorischen Effekt auf das Wachstum von C. sakazakii ES 5 erzielte.

Abstract

Cronobacter sakazakii is a gram-negative bacterium that can cause severe neonatal diseases due to its occurence in powdered infant formula (PIF). The ability to form biofilm increases the resistance of the pathogen to external environmental influences and poses therefore a major problem for the food industry, since cleaning and disinfecting measures often cannot prevent the contamination with C. sakazakii. For Cronobacter spp. a correlation between biofilm formation and persistence outside the host has already been reported, however, no connection to its virulence has yet been established. For this reason a total of 20 C. sakazakii strains of different sources were phenotypically characterized in their biofilm formation under various conditions. Based on the different phenotypic biofilm characteristics, three C. sakazakii strains were selected, their biofilm formation quantified, biochemically analyzed and their virulence examined performing a gentamicin protection assay. To obtain information on the mechanisms during biofilm formation, the studies were carried out simultaneously with the wzx-mutants of the same strains that did not produce LPS. In the phenotypic biofilm characterization it was found that the ability to form biofilm within the species C. sakazakii varies widely and is influenced by environmental factors such as temperature, nutrient supply and surface structure. Biofilm formation was much more pronounced in environmental isolates than in clinical isolates, which confirms the importance of biofilm for the survival of the bacteria in the environment. The biochemical analysis of the extracellular polysaccharide-containing biofilm matrix revealed a high amount of secreted exopolysaccharides (EPS), whereby the detection of a capsule was achieved by separation into cell-bound and extracellular EPS. In addition the production of cellulose as a component of the biofilm matrix was identified. The result of the gentamicin protection assay showed that the bacterial cells from the biofilm (aggregates) were attenuated in their invasivity compared to the planktonic cells. In this context it was also found that aggregates under the stress factor dehydration earlier enter into the VBNC state than the planktonic cells, but their invasiveness after resuscitation was reduced in contrast to the planktonic cells. Furthermore catalase was identified as a factor which induces the resuscitation of the VBNC state into the culturable state. Since this enzyme is secreted by eukaryotic cells, it occurs both in the milk and in the gastrointestinal tract, so that the resuscitation is already induced during the reconstitution of PIF or after its administration in the digestive tract of the newborn so that an infection is facilitated. Furthermore the influence of pathogenic and probiotic bacteria on the growth and virulence of C. sakazakii was investigated in this study. Performing a gentamicin protection assay it was shown that the co-infection with B. cereus and L. monocytogenes facilitated the invasion of C. sakazakii ES 5, whereas the co-infection with probiotic microorganisms produced a contrary effect and protected the eukaryotic epithelial cells from the penetration of the pathogen. On the basis of further studies, it was found in this work that the secretion of antimicrobial substances and the lowering of the pH value by probiotic Lactobacillus inhibited the invasiveness of C. sakazakii. Additionally the establishment of possible approaches for the effective and safe use of probiotics in PIF was achieved, since the addition of sterile supernatants from probiotic Lactobacillus cultures to different infant nutrition such as initial milk, follow up formula and plant-based baby food (mash) has an inhibitory effect on the growth of C. sakazakii ES 5.