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Die Aktivierung der Signalkinase TcsC und des High Osmolarity Glycerol (HOG) Signalwegs in Aspergillus fumigatus als neue Strategie zur Therapie invasiver Schimmelpilzmykosen
Die Aktivierung der Signalkinase TcsC und des High Osmolarity Glycerol (HOG) Signalwegs in Aspergillus fumigatus als neue Strategie zur Therapie invasiver Schimmelpilzmykosen
Neben bakteriellen und viralen Infektionskrankheiten nimmt die Bedeutung von Infektionen durch pathogene Pilze immer weiter zu. Die hohe Mortalitätsrate von invasiven Mykosen, die sich zwischen 40 % und 90 % bewegt, zeigt, dass diese Erkrankungen keinesfalls zu unterschätzen sind. Der Hauptauslöser invasiver Mykosen ist Aspergillus, wobei A. fumigatus die größte Rolle spielt. Jedoch sind auch Infektionen mit Nicht-Aspergillus Schimmelpilzen von zunehmender Bedeutung. Ein besonderes Risiko für die Entwicklung einer invasiven Mykose besteht, sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin, bei immunsupprimierten Patienten. Dazu gehören Patienten, die an AIDS oder CGD leiden, Patienten nach Organ- oder Stammzelltransplantationen oder Patienten die sich einer Therapie mit Immunsuppressiva oder Chemotherapeutika unterziehen müssen. In der Veterinärmedizin spielen auch immunsupprimierende Haltungsbedingungen und Vorerkrankungen wie Tuberkulose eine Rolle. Die Therapie invasiver Mykosen schlägt oft fehl, da die Anzahl der zur Verfügung stehenden Antimykotika begrenzt ist und die Resistenzbildung gegen einige dieser Substanzen in den letzten Jahren stark zunimmt. Es besteht somit ein dringender Bedarf an der Entwicklung neuer therapeutischer Strategien. Einen alternativen Ansatz zu den bisher bekannten Behandlungsmöglichkeiten stellt die Aktivierung eines pilzspezifischen Signalwegs dar, der physiologischerweise unter anderem der Anpassung an hyperosmolaren Stress dient. Die pharmakologische Aktivierung des High Osmolarity Glycerol (HOG) Signalwegs führt zu einem Ungleichgewicht im Wasserhaushalt des Pilzes und kann großen Schaden anrichten, da es zu einem Einstrom von Wasser und damit zum Anschwellen bis hin zum Aufplatzen der Hyphen kommt. In dieser Arbeit wurde der Einfluss sogenannter HOG-aktivierender Substanzen wie Fludioxonil oder Iprodion auf A. fumigatus näher untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass durch die Aktivierung des HOG-Signalwegs zunächst ein fungistatischer Effekt erzielt werden kann, der sich durch eine andauernde Inkubation mit HOG-aktivierenden Substanzen zu einem fungiziden Effekt steigern lässt. Neben dem Anschwellen und Aufplatzen der Hyphen durch den Wassereinstrom lässt sich eine Umstrukturierung der pilzlichen Zellwand beobachten, wie die Freisetzung von Galaktomannan, einer vermehrten Einlagerung von Chitin und die verstärkte Bildung von Septen. Außerdem führt die Aktivierung des HOG-Signalwegs zu weiteren Störungen biologischer Funktionen des Pilzes. So kommt es zur Aufhebung der Kontrollmechanismen der Mitose und des Schließens der Septenporen, was zu einer unkontrollierten Akkumulation von Zellkernen führt. Neben Aspergillus sind auch wichtige Vertreter von Nicht-Aspergillus Schimmelpilzen empfindlich für HOG-aktivierende Substanzen. Infektionen mit diesen Pilzen sind von zunehmender Bedeutung, da sie schwere Krankheitsverläufe auslösen, die oft noch schwerer zu therapieren sind als Infektionen mit Aspergillus. Nach heutigem Wissen wird die Aktivierung des HOG-Signalwegs durch Typ III Hybrid-Histidin-Kinasen vermittelt. Somit bieten diese pilzspezifischen Proteine attraktive Angriffspunkte für die Entwicklung neuer Antimykotika. In dieser Arbeit wurde die Typ III Hybrid-Histidin-Kinase (HHK) TcsC aus A. fumigatus auf molekularer Ebene charakterisiert. Die sich hieraus ergebenden Daten legen nahe, dass es zwei Subklassen von Typ III HHK zu geben scheint, die jeweils typisch für Hefen und typisch für filamentöse Pilze sind. Typ III HHK in Hefen regulieren den HOG-Signalweg in der Regel negativ, sie werden unter osmotischem Stress inaktiviert. In filamentösen Pilzen, wie A. fumigatus, ist das Gegenteil der Fall. Die Typ III HHK reguliert den Signalweg positiv, sie wird erst unter osmotischem Stress aktiv. Dies korreliert auch mit der Aktivität beziehungsweise Inaktivität der isolierten Kinase-Module der jeweiligen Proteine. Handelt es sich um einen negativen Regulator des HOG-Signalwegs, wird das entsprechende Kinase-Modul von der proximalen HAMP-Domäne angeschaltet. Wird der HOG-Signalweg durch die Typ III HHK positiv reguliert, fungiert die proximale HAMP-Domäne als Ausschalter des Kinase-Moduls. In jedem Fall wird somit das Kinase-Modul durch die proximale HAMP-Domäne so reguliert, dass der HOG-Signalweg abgeschaltet wird. Zudem konnten wir zeigen, dass verkürzte TcsC-Varianten einen dominant negativen Effekt auf das native TcsC Protein ausüben. Es ist folglich wahrscheinlich, dass diese Moleküle miteinander interagieren und Dimere bilden können. Es wird davon ausgegangen, dass Typ III HHK zytoplasmatische Osmosensoren sind. Wir konnten jedoch zeigen, dass sich TcsC im Zellkern befindet und erst bei Aktivierung in das Zytoplasma transloziert. Darüber, wie in dieser Lokalisation externe Stresssignale wahrgenommen werden können, kann bisher nur spekuliert werden. Zukünftig sollen weitere HOG-aktivierende Substanzen anhand eines in dieser Arbeit neu etablierten Screening Assays identifiziert und auf ihre Eignung für einen therapeutischen Einsatz hin untersucht werden., In addition to bacterial and viral infectious diseases, the importance of infections caused by pathogenic fungi is increasing. The high mortality rate of invasive mycoses, which ranges from 40% to 90%, shows that these diseases should not be underestimated. The main trigger of invasive mycoses is Aspergillus, with A. fumigatus playing the most important role. However, infections with non-Aspergillus molds are also of increasing importance. There is a particular risk for the development of invasive mycosis, both in human and veterinary medicine, in immunosuppressed patients. These include patients suffering from AIDS or CGD, patients after organ transplantation or stem cell transplantation, or patients undergoing immunosuppressive therapy or chemotherapy. In veterinary medicine, immunosuppressive conditions and pre-existing diseases such as tuberculosis also play a role. The therapy of invasive mycosis often fails due to the limited number of available antimycotics and the incidence of resistance to some of these substances strongly increased in recent years. Therefore, there is an urgent need for the development of new therapeutic strategies. An alternative approach to the hitherto existing treatment options is the activation of the High Osmolarity Glycerol (HOG) pathway, a fungal specific signaling cascade, which physiologically serves, among other things, the adaption to hyperosmotic conditions. The pharmacological activation of the HOG pathway leads to an imbalance of the hydrological balance of the fungus and can cause massive damage, due to an influx of water and subsequent swelling up to bursting of hyphae. In this study, the influence of HOG-activating substances, like Fludioxonil or Iprodione, was examined in more detail. It could be shown that the activation of the HOG pathway results in a fungistatic effect which can be reinforced by a continuous incubation with HOG activating substances to a fungicidal effect. In addition to the swelling and bursting of hyphae by the influx of water, a reorganization of the fungal cell wall can be observed, such as a release of galactomannan, an increased incorporation of chitin and an enhanced formation of septa. Moreover, the activation of the HOG pathway leads to further disturbances of the biological functions of the fungus, the control mechanisms of mitosis and closure of septal pores are abrogated, leading to an uncontrolled accumulation of nuclei. Besides Aspergillus, important representatives of non-Aspergillus fungi are sensitive for HOG activating substances. Infections with these fungi are of increasing importance since they trigger severe pathologies that are often even more difficult to treat than infections with Aspergillus. According to current knowledge, activation of the HOG pathway is mediated by type III hybrid histidine kinases. Thus, these fungi-specific proteins represent attractive target structures for the development of new antifungal agents. In this study, the type III HHK TcsC from A. fumigatus was characterized at the molecular level. The resulting data suggest the existence of two subclasses of type III HHK, typical for yeasts or filamentous fungi. Type III HHKs in yeasts normally regulate the HOG pathway negatively, so they are inactivated under osmotic stress. In filamentous fungi, such as A. fumigatus, the opposite is the case, the type III HHK regulates the signaling pathway positively and becomes active only under osmotic stress. This also correlates with the activity or inactivity of the isolated kinase modules of the respective proteins. In the case of a negative regulator of the HOG pathway, the corresponding kinase module is switched on by the proximal HAMP domain. If the HOG pathway is positively regulated by the type III hybrid histidine kinase, the proximal HAMP domain inactivates the kinase module. In any case, the kinase module is regulated by the proximal HAMP domain in such a way that the HOG pathway is switched off. We also showed that truncated variants of TcsC exert a dominantly negative effect on the native TcsC protein. It is therefore probable that these molecules interact with one another and form dimers. It is assumed that type III hybrid histidine kinases are cytoplasmic osmosensors, but we were able to show that TcsC is located into the cell nucleus and translocates into the cytoplasm only upon activation. How external stress signals can be perceived in this location, can only be speculated so far. In the future, further HOG-activating substances are to be identified using a screening assay newly established in this work and tested for their suitability for therapeutic use.
Not available
Spadinger, Anja
2018
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Spadinger, Anja (2018): Die Aktivierung der Signalkinase TcsC und des High Osmolarity Glycerol (HOG) Signalwegs in Aspergillus fumigatus als neue Strategie zur Therapie invasiver Schimmelpilzmykosen. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Neben bakteriellen und viralen Infektionskrankheiten nimmt die Bedeutung von Infektionen durch pathogene Pilze immer weiter zu. Die hohe Mortalitätsrate von invasiven Mykosen, die sich zwischen 40 % und 90 % bewegt, zeigt, dass diese Erkrankungen keinesfalls zu unterschätzen sind. Der Hauptauslöser invasiver Mykosen ist Aspergillus, wobei A. fumigatus die größte Rolle spielt. Jedoch sind auch Infektionen mit Nicht-Aspergillus Schimmelpilzen von zunehmender Bedeutung. Ein besonderes Risiko für die Entwicklung einer invasiven Mykose besteht, sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin, bei immunsupprimierten Patienten. Dazu gehören Patienten, die an AIDS oder CGD leiden, Patienten nach Organ- oder Stammzelltransplantationen oder Patienten die sich einer Therapie mit Immunsuppressiva oder Chemotherapeutika unterziehen müssen. In der Veterinärmedizin spielen auch immunsupprimierende Haltungsbedingungen und Vorerkrankungen wie Tuberkulose eine Rolle. Die Therapie invasiver Mykosen schlägt oft fehl, da die Anzahl der zur Verfügung stehenden Antimykotika begrenzt ist und die Resistenzbildung gegen einige dieser Substanzen in den letzten Jahren stark zunimmt. Es besteht somit ein dringender Bedarf an der Entwicklung neuer therapeutischer Strategien. Einen alternativen Ansatz zu den bisher bekannten Behandlungsmöglichkeiten stellt die Aktivierung eines pilzspezifischen Signalwegs dar, der physiologischerweise unter anderem der Anpassung an hyperosmolaren Stress dient. Die pharmakologische Aktivierung des High Osmolarity Glycerol (HOG) Signalwegs führt zu einem Ungleichgewicht im Wasserhaushalt des Pilzes und kann großen Schaden anrichten, da es zu einem Einstrom von Wasser und damit zum Anschwellen bis hin zum Aufplatzen der Hyphen kommt. In dieser Arbeit wurde der Einfluss sogenannter HOG-aktivierender Substanzen wie Fludioxonil oder Iprodion auf A. fumigatus näher untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass durch die Aktivierung des HOG-Signalwegs zunächst ein fungistatischer Effekt erzielt werden kann, der sich durch eine andauernde Inkubation mit HOG-aktivierenden Substanzen zu einem fungiziden Effekt steigern lässt. Neben dem Anschwellen und Aufplatzen der Hyphen durch den Wassereinstrom lässt sich eine Umstrukturierung der pilzlichen Zellwand beobachten, wie die Freisetzung von Galaktomannan, einer vermehrten Einlagerung von Chitin und die verstärkte Bildung von Septen. Außerdem führt die Aktivierung des HOG-Signalwegs zu weiteren Störungen biologischer Funktionen des Pilzes. So kommt es zur Aufhebung der Kontrollmechanismen der Mitose und des Schließens der Septenporen, was zu einer unkontrollierten Akkumulation von Zellkernen führt. Neben Aspergillus sind auch wichtige Vertreter von Nicht-Aspergillus Schimmelpilzen empfindlich für HOG-aktivierende Substanzen. Infektionen mit diesen Pilzen sind von zunehmender Bedeutung, da sie schwere Krankheitsverläufe auslösen, die oft noch schwerer zu therapieren sind als Infektionen mit Aspergillus. Nach heutigem Wissen wird die Aktivierung des HOG-Signalwegs durch Typ III Hybrid-Histidin-Kinasen vermittelt. Somit bieten diese pilzspezifischen Proteine attraktive Angriffspunkte für die Entwicklung neuer Antimykotika. In dieser Arbeit wurde die Typ III Hybrid-Histidin-Kinase (HHK) TcsC aus A. fumigatus auf molekularer Ebene charakterisiert. Die sich hieraus ergebenden Daten legen nahe, dass es zwei Subklassen von Typ III HHK zu geben scheint, die jeweils typisch für Hefen und typisch für filamentöse Pilze sind. Typ III HHK in Hefen regulieren den HOG-Signalweg in der Regel negativ, sie werden unter osmotischem Stress inaktiviert. In filamentösen Pilzen, wie A. fumigatus, ist das Gegenteil der Fall. Die Typ III HHK reguliert den Signalweg positiv, sie wird erst unter osmotischem Stress aktiv. Dies korreliert auch mit der Aktivität beziehungsweise Inaktivität der isolierten Kinase-Module der jeweiligen Proteine. Handelt es sich um einen negativen Regulator des HOG-Signalwegs, wird das entsprechende Kinase-Modul von der proximalen HAMP-Domäne angeschaltet. Wird der HOG-Signalweg durch die Typ III HHK positiv reguliert, fungiert die proximale HAMP-Domäne als Ausschalter des Kinase-Moduls. In jedem Fall wird somit das Kinase-Modul durch die proximale HAMP-Domäne so reguliert, dass der HOG-Signalweg abgeschaltet wird. Zudem konnten wir zeigen, dass verkürzte TcsC-Varianten einen dominant negativen Effekt auf das native TcsC Protein ausüben. Es ist folglich wahrscheinlich, dass diese Moleküle miteinander interagieren und Dimere bilden können. Es wird davon ausgegangen, dass Typ III HHK zytoplasmatische Osmosensoren sind. Wir konnten jedoch zeigen, dass sich TcsC im Zellkern befindet und erst bei Aktivierung in das Zytoplasma transloziert. Darüber, wie in dieser Lokalisation externe Stresssignale wahrgenommen werden können, kann bisher nur spekuliert werden. Zukünftig sollen weitere HOG-aktivierende Substanzen anhand eines in dieser Arbeit neu etablierten Screening Assays identifiziert und auf ihre Eignung für einen therapeutischen Einsatz hin untersucht werden.

Abstract

In addition to bacterial and viral infectious diseases, the importance of infections caused by pathogenic fungi is increasing. The high mortality rate of invasive mycoses, which ranges from 40% to 90%, shows that these diseases should not be underestimated. The main trigger of invasive mycoses is Aspergillus, with A. fumigatus playing the most important role. However, infections with non-Aspergillus molds are also of increasing importance. There is a particular risk for the development of invasive mycosis, both in human and veterinary medicine, in immunosuppressed patients. These include patients suffering from AIDS or CGD, patients after organ transplantation or stem cell transplantation, or patients undergoing immunosuppressive therapy or chemotherapy. In veterinary medicine, immunosuppressive conditions and pre-existing diseases such as tuberculosis also play a role. The therapy of invasive mycosis often fails due to the limited number of available antimycotics and the incidence of resistance to some of these substances strongly increased in recent years. Therefore, there is an urgent need for the development of new therapeutic strategies. An alternative approach to the hitherto existing treatment options is the activation of the High Osmolarity Glycerol (HOG) pathway, a fungal specific signaling cascade, which physiologically serves, among other things, the adaption to hyperosmotic conditions. The pharmacological activation of the HOG pathway leads to an imbalance of the hydrological balance of the fungus and can cause massive damage, due to an influx of water and subsequent swelling up to bursting of hyphae. In this study, the influence of HOG-activating substances, like Fludioxonil or Iprodione, was examined in more detail. It could be shown that the activation of the HOG pathway results in a fungistatic effect which can be reinforced by a continuous incubation with HOG activating substances to a fungicidal effect. In addition to the swelling and bursting of hyphae by the influx of water, a reorganization of the fungal cell wall can be observed, such as a release of galactomannan, an increased incorporation of chitin and an enhanced formation of septa. Moreover, the activation of the HOG pathway leads to further disturbances of the biological functions of the fungus, the control mechanisms of mitosis and closure of septal pores are abrogated, leading to an uncontrolled accumulation of nuclei. Besides Aspergillus, important representatives of non-Aspergillus fungi are sensitive for HOG activating substances. Infections with these fungi are of increasing importance since they trigger severe pathologies that are often even more difficult to treat than infections with Aspergillus. According to current knowledge, activation of the HOG pathway is mediated by type III hybrid histidine kinases. Thus, these fungi-specific proteins represent attractive target structures for the development of new antifungal agents. In this study, the type III HHK TcsC from A. fumigatus was characterized at the molecular level. The resulting data suggest the existence of two subclasses of type III HHK, typical for yeasts or filamentous fungi. Type III HHKs in yeasts normally regulate the HOG pathway negatively, so they are inactivated under osmotic stress. In filamentous fungi, such as A. fumigatus, the opposite is the case, the type III HHK regulates the signaling pathway positively and becomes active only under osmotic stress. This also correlates with the activity or inactivity of the isolated kinase modules of the respective proteins. In the case of a negative regulator of the HOG pathway, the corresponding kinase module is switched on by the proximal HAMP domain. If the HOG pathway is positively regulated by the type III hybrid histidine kinase, the proximal HAMP domain inactivates the kinase module. In any case, the kinase module is regulated by the proximal HAMP domain in such a way that the HOG pathway is switched off. We also showed that truncated variants of TcsC exert a dominantly negative effect on the native TcsC protein. It is therefore probable that these molecules interact with one another and form dimers. It is assumed that type III hybrid histidine kinases are cytoplasmic osmosensors, but we were able to show that TcsC is located into the cell nucleus and translocates into the cytoplasm only upon activation. How external stress signals can be perceived in this location, can only be speculated so far. In the future, further HOG-activating substances are to be identified using a screening assay newly established in this work and tested for their suitability for therapeutic use.