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Partikelaufnahme in der Hühnerlunge
Partikelaufnahme in der Hühnerlunge
Der Aufnahmemechanismus, Weitertransport sowie Abbau von inhalierten Partikeln in der Vogellunge sind im Vergleich zur Säugerlunge weitgehend unverstanden. Dies liegt zum einen an den anatomischen Unterschieden und zum anderen an der geringeren Verfügbarkeit spezifischer Marker, insbesondere für aviäre antigenpräsentierende Zellen. Von bestimmten Bereichen der Vogellunge, wie dem follikelassoziierten Epithel (FAE) des Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebes (BALT) oder den Atrienepithelien, wird die Fähigkeit zur Phagozytose angenommen. Umfassende histologische Untersuchungen zur Partikelaufnahme, die dies belegen, sind jedoch nicht vorhanden. Diese Arbeit setzt sich anhand von unterschiedlichen histologischen Techniken umfassend mit der Partikelaufnahme in der Hühnerlunge auseinander. Die Versuche stellen eine histologische Annäherung an das Thema Partikelaufnahme in der Vogellunge dar und dienen als Grundlage für die Etablierung von geeigneten in vivo-Versuchs-modellen für die histologische Analyse. Aus diesem Grund – und insbesondere aus Tierschutzgründen – wurde die Applikation in Anlehnung an beschriebene Infektionsversuche kurze Zeit post mortem durchgeführt. Um die Heterogenität der Partikel in der Stallluft abzubilden, wurden unterschiedliche Partikel tracheal appliziert (Tusche, Latex-Beads, Fluoresceinisothiocyanat, Neutralrot, E. coli). Die Vitalität des Gewebes wurde anhand von Vitalitätsfärbungen bestätigt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen deutlich, dass alle eingegebenen Partikel sowie E. coli-Bakterien durch das Atrienepithel aufgenommen werden und belegen damit dessen postulierte Phagozytosefähigkeit. Entgegen den Forschungs-ergebnissen beim Säuger ist im Bereich des FAE des Hühner-BALT nur eine geringe Aufnahmekapazität für Tusche und Beads darstellbar, wohingegen FITC (Fluoresceinisothiocyanat) effektiv durch das gesamte FAE aufgenommen wird. Hinweise zum Abtransport der Partikel lassen sich aus den histologischen Befunden ableiten. Sowohl Tusche als auch Beads sind vermehrt in den interparabronchialen Septen und teilweise in der Nähe extrabronchialer germinaler Zentren (GCs) sowie den Blutgefäßen darstellbar. In den GCs älterer Tiere finden sich regelmäßig Partikelablagerungen, die teilweise positiv mit dem anti Pan-Zytokeratin-Antikörper reagieren und Federstaub entsprechen können. Die GCs können somit einen Ablageort für inhalierte Partikel darstellen, ähnlich wie dies bei Säugerlymphknoten beschrieben ist. Aufgrund dieser Ergebnisse und zum besseren Verständnis der pulmonalen GCs wurde eine dreidimensionale Rekonstruktion der GCs erstellt. Diese zeigte, dass sich die GCs der Lunge von den typisch kugeligen Milz-GCs unterscheiden und an die strukturellen Besonder-heiten der Lunge angepasst sind. Neutralrot, Kohlenstoffpartikel aus der Tusche und Beads werden den Ergebnissen der Arbeit nach durch Makrophagen bzw. dendritische Zellen im Bereich der Atriensepten aufgenommen und somit möglicherweise zellulär zu den Blutgefäßen und interparabronchialen Septen transportiert. Die interparabronchialen Septen können eine lymphatische Drainage der Lunge darstellen, der Nachweis von Lymphendothelzellen gelang mit den zur Verfügung stehenden Antikörpern allerdings nicht. Allein FITC reichert sich in den Epithelien des Primärbronchus und der Atrien an und findet sich nur vereinzelt im Bindegewebe. Die Identifizierung der FITC-assoziierten Zellen gelang mit den derzeit verfügbaren Markern jedoch nicht. Die antigenspezifische Immunantwort wurde im Rahmen einer Impfung mit dem Newcastle Disease Virus durch Genexpressionsanalysen in Abhängigkeit der verschiedenen Kompartimente der Lunge (Primärbronchus, Parenchym, Trachea) und der Milz untersucht. Die konjunktivale Impfung führt sowohl zu einer systemischen als auch pulmonalen Immunantwort in Form eines Anstiegs der B Zellen und des Enzyms AID (activation induced cytidine deaminase), das im Rahmen der germinalen Zentrumsreaktion exprimiert wird. Immunhisto-chemische Untersuchungen als Ansatz eines histologischen Verständnisses der immunologischen Vorgänge weisen hierbei sowohl auf eine Beteiligung des BALT (Anstieg der GC-Zahl) als auch auf eine schleimhautassoziierte Immunität hin (Anstieg der IgA-Sekretion). Auf den hier etablierten Versuchsmodellen aufbauend, kann der Weg inhalierter Partikel durch in vivo-Studien gezielt analysiert und die Frage nach dem Abtransport aus der Lunge nach Aufnahme durch das Atrienepithel bzw. das FAE weiterverfolgt werden., In contrast to the mammalian lung comparatively little is known about the avian respiratory immune system and the mechanisms by which inhaled particles are taken up, transported and degraded. The anatomical differences compared to the mammalian lung as well as the scarcity of known immune cell markers are complicating the analysis. Some pulmonary structures like the atrial and the follicle associated epithelium (FAE) of the bronchus associated lymphoid tissue (BALT) are suspected to be capable of endocytosis. But extensive histological studies focusing on the particle uptake in the avian lung are missing to this day. Therefore this work’s aim is to analyze the route of tracheally applied particles and to characterize the cells involved in particle uptake by histological and immunohistochemical methods. The experiments of this work represent a histological approach towards the understanding of particle uptake in the avian lung and help to establish a suitable experimental design for further histological studies on the chicken lung. Taking this into account and due to animal welfare reasons the experiments were performed post mortem on the basis of infection models of cultured lung tissue. To imitate the heterogeneity of dust particles inhaled by chickens under conventional housing conditions different types of particles were used (ink, beads, fluorescein isothiocyanate, neutral red, E. coli). The viability of the lung tissue was confirmed by neutral red as a viability marker. This work’s detailed histological study clearly shows the uptake of all applied particles, chemicals and the E. coli bacteria by the atrial epithelium, confirming its postulated phagocytic capacity. In contrast to research results concerning the mammalian BALT there is only little uptake of ink (approx. 2 µm) and latex beads (1 µm) by the FAE of the avian BALT, whereas FITC (fluorescein isothiocyanate) is taken up effectively. There is histological evidence of a possible path of particle transport after entering the lung. The carbon particles of the ink as well as the latex beads can be found in increased number inside the inter-parabronchial septa and also partly near extrabronchial germinal centers (GC) or inside the pulmonary blood vessels. GCs of older animals regularly show deposition of heterogeneous particles, which partly can be stained by the anti pan cytokeratin antibody and therefore could represent feather keratins. This finding suggests that the GCs play a role as a place of antigen presentation and deposition similar to the mammalian pulmonary lymph nodes. Furthermore neutral red, carbon particles and latex beads are taken up by macrophages and dendritic cells respectively localized within the atrial septa. Therefore the particle transport towards the interparabronchial septa, GCs or blood vessels could take place by cellular mechanisms. The interparabronchial septa could function as lymphatic vessels of the lung, though the existence of lymphatic endothelial cells could not be proven by currently available antibodies. FITC is found mainly inside the epithelium of the primary bronchus and the atria, while there is only little FITC within the connective tissue, but currently available antibodies failed to characterize the FITC associated cells. The antigen specific immune response was investigated by NDV-vaccination in consideration of the different bronchial and extrabronchial compartments (primary bronchus, parenchyma, trachea) and the spleen. The conjunctival vaccination leads both to a systemic and local immune response in terms of an increase of the gene expression of B cells and the enzyme AID (activation induced cytidine deaminase) as a marker of the germinal center reaction. Immunohistochemical analysis as a step towards understanding the pulmonary immune reaction indicates a participation of the BALT (increase of number of GCs) as well as a mucosal immunity (increase of IgA secretion). The experimental design established in this work can be used to analyze the particle uptake in the avian lung by in vivo studies and thus helps to answer the question how and where particles are transported after uptake by the atrial or follicle associated epithelium.
Partikelaufnahme, aviär, Vogel, Huhn, dendritische Zelle, particle uptake, avian, bird, chicken, dendritic cell, macrophage, Makrophage, BALT, immune system, NDV, 3D reconstruction, histology, anatomy, Histologie, Anatomie
Wilhelm, Alina
2018
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Wilhelm, Alina (2018): Partikelaufnahme in der Hühnerlunge. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Der Aufnahmemechanismus, Weitertransport sowie Abbau von inhalierten Partikeln in der Vogellunge sind im Vergleich zur Säugerlunge weitgehend unverstanden. Dies liegt zum einen an den anatomischen Unterschieden und zum anderen an der geringeren Verfügbarkeit spezifischer Marker, insbesondere für aviäre antigenpräsentierende Zellen. Von bestimmten Bereichen der Vogellunge, wie dem follikelassoziierten Epithel (FAE) des Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebes (BALT) oder den Atrienepithelien, wird die Fähigkeit zur Phagozytose angenommen. Umfassende histologische Untersuchungen zur Partikelaufnahme, die dies belegen, sind jedoch nicht vorhanden. Diese Arbeit setzt sich anhand von unterschiedlichen histologischen Techniken umfassend mit der Partikelaufnahme in der Hühnerlunge auseinander. Die Versuche stellen eine histologische Annäherung an das Thema Partikelaufnahme in der Vogellunge dar und dienen als Grundlage für die Etablierung von geeigneten in vivo-Versuchs-modellen für die histologische Analyse. Aus diesem Grund – und insbesondere aus Tierschutzgründen – wurde die Applikation in Anlehnung an beschriebene Infektionsversuche kurze Zeit post mortem durchgeführt. Um die Heterogenität der Partikel in der Stallluft abzubilden, wurden unterschiedliche Partikel tracheal appliziert (Tusche, Latex-Beads, Fluoresceinisothiocyanat, Neutralrot, E. coli). Die Vitalität des Gewebes wurde anhand von Vitalitätsfärbungen bestätigt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen deutlich, dass alle eingegebenen Partikel sowie E. coli-Bakterien durch das Atrienepithel aufgenommen werden und belegen damit dessen postulierte Phagozytosefähigkeit. Entgegen den Forschungs-ergebnissen beim Säuger ist im Bereich des FAE des Hühner-BALT nur eine geringe Aufnahmekapazität für Tusche und Beads darstellbar, wohingegen FITC (Fluoresceinisothiocyanat) effektiv durch das gesamte FAE aufgenommen wird. Hinweise zum Abtransport der Partikel lassen sich aus den histologischen Befunden ableiten. Sowohl Tusche als auch Beads sind vermehrt in den interparabronchialen Septen und teilweise in der Nähe extrabronchialer germinaler Zentren (GCs) sowie den Blutgefäßen darstellbar. In den GCs älterer Tiere finden sich regelmäßig Partikelablagerungen, die teilweise positiv mit dem anti Pan-Zytokeratin-Antikörper reagieren und Federstaub entsprechen können. Die GCs können somit einen Ablageort für inhalierte Partikel darstellen, ähnlich wie dies bei Säugerlymphknoten beschrieben ist. Aufgrund dieser Ergebnisse und zum besseren Verständnis der pulmonalen GCs wurde eine dreidimensionale Rekonstruktion der GCs erstellt. Diese zeigte, dass sich die GCs der Lunge von den typisch kugeligen Milz-GCs unterscheiden und an die strukturellen Besonder-heiten der Lunge angepasst sind. Neutralrot, Kohlenstoffpartikel aus der Tusche und Beads werden den Ergebnissen der Arbeit nach durch Makrophagen bzw. dendritische Zellen im Bereich der Atriensepten aufgenommen und somit möglicherweise zellulär zu den Blutgefäßen und interparabronchialen Septen transportiert. Die interparabronchialen Septen können eine lymphatische Drainage der Lunge darstellen, der Nachweis von Lymphendothelzellen gelang mit den zur Verfügung stehenden Antikörpern allerdings nicht. Allein FITC reichert sich in den Epithelien des Primärbronchus und der Atrien an und findet sich nur vereinzelt im Bindegewebe. Die Identifizierung der FITC-assoziierten Zellen gelang mit den derzeit verfügbaren Markern jedoch nicht. Die antigenspezifische Immunantwort wurde im Rahmen einer Impfung mit dem Newcastle Disease Virus durch Genexpressionsanalysen in Abhängigkeit der verschiedenen Kompartimente der Lunge (Primärbronchus, Parenchym, Trachea) und der Milz untersucht. Die konjunktivale Impfung führt sowohl zu einer systemischen als auch pulmonalen Immunantwort in Form eines Anstiegs der B Zellen und des Enzyms AID (activation induced cytidine deaminase), das im Rahmen der germinalen Zentrumsreaktion exprimiert wird. Immunhisto-chemische Untersuchungen als Ansatz eines histologischen Verständnisses der immunologischen Vorgänge weisen hierbei sowohl auf eine Beteiligung des BALT (Anstieg der GC-Zahl) als auch auf eine schleimhautassoziierte Immunität hin (Anstieg der IgA-Sekretion). Auf den hier etablierten Versuchsmodellen aufbauend, kann der Weg inhalierter Partikel durch in vivo-Studien gezielt analysiert und die Frage nach dem Abtransport aus der Lunge nach Aufnahme durch das Atrienepithel bzw. das FAE weiterverfolgt werden.

Abstract

In contrast to the mammalian lung comparatively little is known about the avian respiratory immune system and the mechanisms by which inhaled particles are taken up, transported and degraded. The anatomical differences compared to the mammalian lung as well as the scarcity of known immune cell markers are complicating the analysis. Some pulmonary structures like the atrial and the follicle associated epithelium (FAE) of the bronchus associated lymphoid tissue (BALT) are suspected to be capable of endocytosis. But extensive histological studies focusing on the particle uptake in the avian lung are missing to this day. Therefore this work’s aim is to analyze the route of tracheally applied particles and to characterize the cells involved in particle uptake by histological and immunohistochemical methods. The experiments of this work represent a histological approach towards the understanding of particle uptake in the avian lung and help to establish a suitable experimental design for further histological studies on the chicken lung. Taking this into account and due to animal welfare reasons the experiments were performed post mortem on the basis of infection models of cultured lung tissue. To imitate the heterogeneity of dust particles inhaled by chickens under conventional housing conditions different types of particles were used (ink, beads, fluorescein isothiocyanate, neutral red, E. coli). The viability of the lung tissue was confirmed by neutral red as a viability marker. This work’s detailed histological study clearly shows the uptake of all applied particles, chemicals and the E. coli bacteria by the atrial epithelium, confirming its postulated phagocytic capacity. In contrast to research results concerning the mammalian BALT there is only little uptake of ink (approx. 2 µm) and latex beads (1 µm) by the FAE of the avian BALT, whereas FITC (fluorescein isothiocyanate) is taken up effectively. There is histological evidence of a possible path of particle transport after entering the lung. The carbon particles of the ink as well as the latex beads can be found in increased number inside the inter-parabronchial septa and also partly near extrabronchial germinal centers (GC) or inside the pulmonary blood vessels. GCs of older animals regularly show deposition of heterogeneous particles, which partly can be stained by the anti pan cytokeratin antibody and therefore could represent feather keratins. This finding suggests that the GCs play a role as a place of antigen presentation and deposition similar to the mammalian pulmonary lymph nodes. Furthermore neutral red, carbon particles and latex beads are taken up by macrophages and dendritic cells respectively localized within the atrial septa. Therefore the particle transport towards the interparabronchial septa, GCs or blood vessels could take place by cellular mechanisms. The interparabronchial septa could function as lymphatic vessels of the lung, though the existence of lymphatic endothelial cells could not be proven by currently available antibodies. FITC is found mainly inside the epithelium of the primary bronchus and the atria, while there is only little FITC within the connective tissue, but currently available antibodies failed to characterize the FITC associated cells. The antigen specific immune response was investigated by NDV-vaccination in consideration of the different bronchial and extrabronchial compartments (primary bronchus, parenchyma, trachea) and the spleen. The conjunctival vaccination leads both to a systemic and local immune response in terms of an increase of the gene expression of B cells and the enzyme AID (activation induced cytidine deaminase) as a marker of the germinal center reaction. Immunohistochemical analysis as a step towards understanding the pulmonary immune reaction indicates a participation of the BALT (increase of number of GCs) as well as a mucosal immunity (increase of IgA secretion). The experimental design established in this work can be used to analyze the particle uptake in the avian lung by in vivo studies and thus helps to answer the question how and where particles are transported after uptake by the atrial or follicle associated epithelium.