Studies of UHRF1-mediated mechanisms regulating DNA methyltransferase 1

Smets, Martha (2017): Studies of UHRF1-mediated mechanisms regulating DNA methyltransferase 1. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

Epigenetic processes include the establishment, maintenance and coordinated change of DNA and histone modifications to shape chromatin structure across cell divisions without affecting the DNA sequence. This thesis addresses the Regulation of DNA methylation with particular focus on the interplay between epigenetic factors DNMT1 and UHRF1, their role during development and disease as well as technology advancements in genome editing and transcriptomics towards better understanding of chromatin biology. The field of epigenetics increasingly relies on genome editing and genome-wide transcriptomic analyses as key technologies to study and understand the Regulation of individual genes, their protein products as well as systemic effects on gene expression. During my PhD, I co-established a multifunctional integrase (MIN) tag for rapid and versatile genome engineering. Based on CRISPR/Cas mediated manipulation, this approach enables efficient generation of multiple isogenic cell lines to study gene function under physiological conditions. Moreover, I participated in a comprehensive study comparing different library preparation methods for single-cell transcriptomic analyses. The main study of this thesis focuses on mutations in the TS domain of DNMT1 that are linked to a neurodegenerative disease called HSAN1E. Here, we characterized two disease related mutations with functional complementation assays in mouse embryonic stem cells. We showed that these mutations impair both interaction with UHRF1 and DNMT1 heterochromatin association resulting in decreased methylation levels. The next objective of this work was to investigate UHRF1-mediated modifications and their functional interplay with DNMT1 regulating DNA methylation. We identified H3K18 as a novel ubiquitination target of UHRF1. H3K18ub is essential for DNMT1 targeting and function. Consequently, we identified a ubiquitin interacting motif (UIM) within the TS domain of DNMT1, responsible for binding H3K18ub. Finally, with UHRF1 and UHRF2 single knockout ESCs, we assayed for differential ubiquitination using mass spectrometry and identified novel non-histone ubiquitination targets. We show that UHRF1 ubiquitinates PAF15 at Lys 15 and Lys 24 and thereby promotes its binding to PCNA during late s phase. Together my findings indicate a novel functional aspect of UHRF1 in regulating DNA methylation via H3K18ub and suggest a non-epigenetic role in DNA damage response. Despite sequence and domain similarity of UHRF1 and UHRF2, my results suggest that UHRF1/2 are involved in different cellular pathways, arguing for non-redundant functions.

Abstract

Epigenetische Prozesse umfassen die Etablierung, Aufrechterhaltung und koordinierte Veränderung von DNA- und Histon-Modifikationen. Desweiteren beeinflussen sie die Chromatinstruktur während des Zellzyklus, ohne dass die DNS Sequenz verändert wird. Diese Doktorarbeit beschäftigt sich mit den molekularen Mechanismen der DNS-Methylierung mit besonderem Fokus auf dem funktionellen Zusammenspiel der epigenetischen Faktoren DNMT1 und UHRF1 und ihrer Funktion in der embryonalen Entwicklung. Desweiteren werden technologische Fortschritte in der Genommanipulation und Transkriptomanalyse zum besseren Verständnis der Chromatinbiologie beschrieben. Das Feld der Epigenetik setzt zunehmend auf Genommanipulation und genomweite Transkriptomanalysen als Schlüsseltechnologien, um die Regulation einzelner Gene, ihre Proteinprodukte sowie systemische Effekte auf das zelluläre Transkriptom zu untersuchen und zu verstehen. Während meiner Promotion habe ich das multifunctional integrase (MIN) tag System für eine schnelle und vielseitige Genommanipulation mitetabliert. Basierend auf CRISPR/Cas-vermittelten Manipulationen ermöglicht dieser Ansatz eine effiziente Generierung von isogenen Zelllinien, um individuelle Gene unter physiologischen Bedingungen zu untersuchen. Darüber hinaus habe ich an einer umfassenden Studie teilgenommen, in deren Rahmen verschiedene Verfahren der Einzelzell-Transkriptomanalyse verglichen wurden. Die Hauptstudie dieser Arbeit konzentriert sich auf Mutationen in der TS-Domäne von DNMT1, die mit einer neurodegenerativen Erkrankung namens HSAN1E assoziiert sind. Hier haben wir zwei krankheitsbezogene Mutationen mit Komplementierungsexperimenten in embryonalen Stammzellen charakterisiert. Wir haben gezeigt, dass diese Mutationen sowohl die Bindung von DNMT1 an Heterochromatin als auch die Interaktion mit UHRF1 beeinträchtigen, was zu einem verringerten Methylierungslevel führt. Das nächste Ziel dieser Arbeit war es, UHRF1-vermittelte osttranslationale Modifikationen und deren Einfluss auf die Regulation von DNMT1 zu untersuchen. Wir identifizierten H3K18 als eine neue Histonubiquitinierungsstelle, die von UHRF1 ubiquitiniert wird. H3K18ub ist essentiell für die Funktion von DNMT1. In der Folge haben wir ein ubiquitin interacting motif (UIM) innerhalb der TS-Domäne von DNMT1 identifiziert, das für die Bindung von H3K18ub verantwortlich ist. Schließlich wurden embryonale UHRF1- und UHRF2-knockout Stammzellen auf differenzielle Ubiquitinierung mittels Massenspektrometrie untersucht und neue Ubiquitinierungssubstrate identifiziert. Wir zeigen, dass UHRF1 PAF15 ubiquitiniert und damit die Bindung von PAF15 an PCNA in der späten S-Phase fördert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen einen neuen funktionellen Aspekt von UHRF1 bei der Regulation der DNS-Methylierung über H3K18ub und deuten auf eine Funktion bei der Reparatur von DNS-Schäden hin. Trotz der Ähnlichkeit von Sequenz und Domänenstruktur von UHRF1 und UHRF2 deuten die Ergebnisse darauf hin, dass UHRF1/2 an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt sind und unterschiedliche Funktionen haben.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 6. Dezember 2017
• 1. Bericht­erstatter:in: Leonhardt, Heinrich