Torsional properties of DNA probed with magnetic (torque) tweezers

Kriegel, Franziska (2017): Torsional properties of DNA probed with magnetic (torque) tweezers. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik

Abstract

Die Natur hat eine einzigartige Struktur entwickelt um die DNS, unser Erbgut, zu schützen und zu übertragen. Für die Entdeckung dieser komplexen Struktur wurde 1962 der Nobelpreis vergeben. Die DNS trägt die Information unseres Erbguts in ihrer Sequenz. Die sich im Inneren der DNS befindlichen Basen charakterisieren das Genom und sind geschützt durch das doppelsträngige Rückgrat. Um auf die Information zurückgreifen zu können, muss die Doppelhelix geöffnet, sozusagen entwunden werden. Für diesen Vorgang müssen Drehkräfte wirken. Aus diesem Grund werden biologische Prozesse, wie Replikation und Transkription, durch Drehmomente reguliert. Die Topologie, die eine DNS annimmt, ist daher für das Leben essentiell und zudem streng reguliert durch eine Gruppe von Enzymen – den Topoisomerasen. Topoisomerasen sind so bedeutsam, dass ihre Entnahme aus der Zelle, nach kurzer Zeit den Zelltod zur Folge hat. Dieses Verfahren wird in der Medizin oft angewendet, um Krebszellen zu bekämpfen und zu töten. Folglich ist es von herausragender Bedeutung, das Verhalten von DNS unter der Wirkung von Drehkräften zu untersuchen und zu verstehen. Einige Einzelmolekültechniken wurden in den letzten Jahren entwickelt, um an Molekülen im pN Bereich zu ziehen oder zu drehen. Verhältnismäßig neu ist die Möglichkeit das Drehmoment einzelner Moleküle, unter anderem der DNS, direkt zu messen. Die Magnetische Pinzette ist hierbei die prominenteste Technik. Bisher konnte man bei direkten Drehmomentmessungen nur je ein Molekül nach dem anderen studieren. Diese Einzelbetrachtung erschwert das Erheben von Statistiken ungemein. In dieser Arbeit stelle ich eine vereinfachte und temperaturkontrollierte Version der Magnetischen Pinzette vor, die außerdem mehrere Moleküle gleichzeitig messen kann, um Dreheigenschaften der DNS zu untersuchen. Ich zeige, dass sowohl die Frei Drehbaren Magnetischen Pinzetten als auch die Magnetischen Drehmoment Pinzetten, unter den richtigen Bedingungen – zum Beispiel den magnetischen Kugeln – für parallele Messungen verwendet werden können. Außerdem zeige ich, dass die Kraftkalibrierungen in beiden Verfahren gleich sind. Dieser Umstand erlaubt es, diese direkt in den Magnetischen Drehmoment Pinzetten anzuwenden ohne vorab die Frei Drehbaren Magnetischen Pinzetten zu etablieren. Mit diesen Ergebnissen habe ich eine multiple Form der Magnetischen Drehmoment Pinzette entwickelt und somit Ausdehnungs- und Drehmomentmessungen von DNS gemacht, die eine Untersuchung der Struktur des Moleküls ermöglichen. Der Einfluss von äußeren Faktoren, wie zum Beispiel der Salzgehalt oder die Temperatur auf Dreheigenschaften des Moleküls, sind höchst relevant für biologische Prozesse. Mit den vorab genannten Ergebnissen und Verbesserungen in der Technik habe ich diese Fragestellungen systematisch genau untersucht. Zuerst habe ich die intrinsische Drehsteifigkeit (bei großen Zugkräften, die Biegeeffekte unterdrücken) der DNS unter verschiedenen Salzkonzentrationen analysiert. Ein Ergebnis dieser Untersuchung ist, dass diese salzunabhängig ist. Die effektive Drehsteifigkeit wird bei kleineren Zugkräften gemessen, sodass Drehenergie in Biegeenergie übergeht. Die effektive Drehsteifigkeit nimmt mit erhöhter Salzkonzentration ab, was allerdings als reiner Biegeeffekt verstanden wird. Dieselben Daten konnten wir mit Molekulardynamischen Simulationen vergleichen und kommen zu dem Schluss, dass das Modell der asymmetrischen, anisotropischen, drehbaren, wurmartigen Kette, die beste Übereinstimmung liefert. Die salzabhängige Studie und der Vergleich mit den Simulationen zeigen, dass Drehung und Biegung auch intrinsisch in DNS gekoppelt sind. Neben der Kontrolle der Salzkonzentration in Lösung, entwickelte ich eine Objektivheizung, um die Temperatur während einer Messung präzise zu regulieren. Ich studierte die Veränderung der Windung der DNS und stellte fest, dass die Entwindung mit Temperatur unabhängig von der Zugkraft ist. Vergleicht man experimentelle Ergebnisse mit theoretischen Vorhersagen in Form von Molekulardynamik Simulationen, so haben wir herausgefunden, dass der Effekt durch eine reine Konformationsänderung im DNS-Rückgrat und nicht durch das Schmelzen von Basenpaaren verursacht wird. Diese Konformationsänderung deutet darauf hin, dass sich die Torsionssteifigkeit auch bei erhöhter Temperatur ändert. Ich präsentiere erste Drehmomentmessungen bei erhöhter Temperatur und vergleiche diese mit Ergebnissen von Molekulardynamischen Simulationen. Zusammenfassend präsentiere ich eine neuartige Methode, um das molekulare Drehmoment der DNS in einer parallelen Weise zu studieren und komme zu dem Ergebnis, dass die Zunahme der Salzkonzentration und Temperatur im biologisch relevanten Bereich, die DNS weicher macht, nicht nur im Hinblick auf die Biegung, sondern auch in der Verdrehung.

Abstract

Nature has developed an inimitably strategy to store and transfer genetic information in the sequence of the double helix of DNA, for its structure the Noble Price has been awarded in 1962. The bases, which carry the genetic information, are located in the interior of the DNA and protected by the double-stranded backbone. During DNA replication or transcription, a well-regulated molecular torque unwinds the double helix to access genes that are located within the helix. DNA topology in the cell is strictly regulated by a group of enzymes called topoisomerases. An inhibition of topoisomerase rapidly causes cell death and can be used to destroy cancer cells. An in depth understanding of the topological and torsional properties of the DNA double helix is therefore essential to life. Single-molecule techniques have been developed over the last decade to implement precise and well controlled forces and torques on the pN level to stretch and twist molecules to extract their structural information. Methods have been further extended to directly address molecular torque in nucleic acids, such as DNA by implementing magnetic tweezers, the most prominent technique to date. So far molecular torque measurements have been limited to a ``one-molecule-at-a-time'' method, lacking high statistics. In this thesis, I present a multiplexed, temperature-controlled and straightforward version of magnetic torque tweezers to probe torsional properties of DNA, such as its helical twist and its torsional stiffness. I demonstrate that both freely orbiting magnetic tweezers (FOMT) and magnetic torque tweezers (MTT) can operate in a multiplexed fashion for properly chosen measurement parameters. It is noteworthy that force calibrations in FOMT and MTT are similar, thus force calibrations can be performed directly in MTT. I developed a multiplexed version of MTT resulting in high-resolution extension-rotation and torque-rotation measurements of double-stranded DNA, giving the opportunity to extract information of structural properties. The torsional response of DNA to changes in the environment, such as salt concentration or temperature, is an important parameter in the understanding of the mechanical behavior of DNA. Implementing the previously established methods I aimed at systematically studying its (DNA’s) dependence on various parameters. For this I tested different salt concentrations and found that the intrinsic torsional stiffness does not depend on salt (i.e. at stretching forces that suppress bending). The effective torsional stiffness, however, governs the respond to induced torque at smaller stretching forces, where some of the twist is topologically transformed into bending. I found that the effective torsional stiffness decreases with increasing ionic strength, which is understood by a pure decrease in bending stiffness. At the same time we could use the high-resolution data (at physiological relevant salt) to compare with coarse-grained simulations of DNA and find best agreement, when using the asymmetric, anisotropic twistable worm-like chain. The salt dependent study and the comparison with simulations underlay that bending and twisting are also intrinsically coupled in DNA. Besides controlling the salt concentration in solution, I developed a magnetic tweezers instrument with an add-on objective heating to precisely control temperature to study the change in helical twist of DNA and find that the unwinding effect is independent on stretching force. Comparing experimental results with theoretical predictions in form of all-atom molecular dynamics simulations, we unveiled that the effect is caused purely by a conformational change in the DNA backbone and not a consequence of melting of base pairs. This conformational change suggests that the torsional stiffness also changes upon increased temperature. I present preliminary torque-rotation data at increased temperature and compare those with results of coarse-grained and all-atom molecular dynamic simulations. Taken together, I present a novel experimental concept to address molecular torque of DNA in a parallelized and straightforward fashion. Using this method I find that the increase of salt concentration and temperature, within biological relevant regimes, softens the DNA molecule not only in terms of bending but also in terms of twisting.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
• Fakultäten: Fakultät für Physik
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 7. Dezember 2017
• 1. Bericht­erstatter:in: Lipfert, Jan