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Synthese und Untersuchung kohlenstoffsubstituierter DNA-Basen
Synthese und Untersuchung kohlenstoffsubstituierter DNA-Basen
Diese Promotionsarbeit befasst sich mit aryl- und alkylmodifizierten DNA-Basen. Zum einen wurden die Phosphoramidite arylsubstituierter DNA-Basen für die Untersuchung des Mechanismus der Nukleotidexzisionsreparatur (NER) synthetisiert und in DNA-Stränge eingebaut. Zum anderen wurden isotopenmarkierte Standards methylierter DNA-Basen für deren Massenspektrometrie-basierte Quantifizierung in unterschiedlichen Zellen und Geweben hergestellt. Die Aktivierung bzw. Stilllegung bestimmter Gene zu bestimmten Zeiten, wird in Säugetieren unter anderem durch die Methylierung von 2‘ Desoxycytidin (dC) zu 5-Methyl-2‘ desoxycytidin (m5dC) in der Promotorenregion des jeweiligen Gens durch DNA-Methyltransferasen mit S-Adenosylmethionin (SAM) als Cofaktor bewerkstelligt. Im Arbeitskreis Carell werden Fütterungsexperimente durchgeführt, bei denen dem Medium embryonaler Stammzellen der Maus (mES-Zellen) [13CD3]-Methionin zugefügt wird. Dieses wird zu SAM verstoffwechselt, sodass die deuterierte, 13C-markierte Methylgruppe letztendlich [13CD3]-m5dC generiert. Dank der Isotopenmarkierung lässt sich das Schicksal der Methylgruppe verfolgen. Im Zuge dieser Arbeit wurde 5-[D3]-Methyl-2‘-desoxy-[6 D, 1,3 15N2]-cytidin ([D4, 15N2]-m5dC) als interner m5dC[+6] Standard für die Quantifizierung des schweren m5dC synthetisiert. Des Weiteren wurden 4-Methyl-2‘ desoxy-[1,3-15N2]-cytidin ([15N2]-m4dC) und 6-[D3]-Methyl-2’ desoxyadenosin ([D3]-m6dA) als Standards für die Quantifizierung von m4dC und m6dA in unterschiedlichen Organismen, sowie unmarkiertes m6dA für die Erstellung einer Eichgeraden synthetisiert. Diese beiden Modifikationen sind seit langem in Bakterien bekannt und 2015 konnte m6dA zusätzlich in verschiedenen eukaryotischen Organismen nachgewiesen werden. Durch die hier synthetisierten Standards konnten wir eine ultrasensitive UHPLC-MS-Methode (Ultra High Performance Liquid Chromatography gekoppelt mit Massenspektrometrie) entwickeln, mit der auch der Nachweis kleinster Mengen dieser methylierten Basen in der DNA möglich war. m4dC konnte einzig in Bakterien nachgewiesen werden, m6dA zusätzlich noch in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, welche als Positivkontrolle verwendet wurde. Anders als in der Literatur beschrieben, konnten wir jedoch kein m6dA in mES-Zellen oder im Gewebe erwachsener Mäuse detektieren. Dies relativiert die zahlreichen Berichte über den Nachweis dieser Modifikation in den unterschiedlichsten Wirbeltieren. Der andere Teil dieser Promotionsarbeit befasst sich mit arylsubstituierten DNA-Basen. Die sperrigen DNA-Addukte zwischen 2‘ Desoxyguanosin (dG) und aromatischen Amiden bzw. Aminen werden durch die NER erkannt und repariert. Die Proteine der Xeroderma Pigmentosum (XP) Familie und insbesondere das XPA-Protein sind maßgeblich an der Erkennung und an der Reparatur dieser Schäden beteiligt. 2015 konnte im Arbeitskreis Carell die Kristallstruktur mit Acetylaminofluoren (AAF) in C8 Position von dG geschädigter DNA und Rad14, dem Hefehomolog von XPA, erhalten werden. Diese Struktur weist auf eine Rolle von XPA/Rad14 in der Schadenserkennung hin, wobei die DNA auf ihre Biegsamkeit überprüft wird. Im Zuge dieser Arbeit wurden DNA-Stränge mit weiteren C8-dG-Addukten hergestellt, welche sich in der Größe des aromatischen Rests unterschieden. Zusätzlich wurden die Phosphoramidite verschiedener N2 dG-Addukte synthetisiert, welche ebenfalls unterschiedlich große aromatische Reste besaßen, ebenso wie das Phosphoramidit des C8-AAF-Addukts mit 2‘ Desoxyadenosin (dA). Auch die Synthese von DNA-Strängen, welche diese Addukte enthielten, war erfolgreich. EMSA-Studien (Electrophoretic Mobility Shift Assay) konnten eine höhere Affinität von XPA für sämtliche synthetisierte geschädigte doppelsträngige DNA im Vergleich zu ungeschädigter DNA bestätigen. Für alle Doppelstränge, die C8-Addukte enthielten, sowie für den Doppelstrang mit N2 Acetylaminonaphthalin(AAN)-dG als Schaden, konnten Kristallstrukturen mit Rad14 erhalten werden. Analog zur C8-AAF-dG Struktur binden in all diesen Strukturen immer zwei Rad14-Moleküle an die DNA, wobei der Kontakt hauptsächlich über die β Schleife mit dem Phosphatrückgrat stattfindet, also sequenzunabhängig ist. Hierbei kommt es zu keinem direkten Kontakt mit dem Schaden, was mit der Tatsache im Einklang ist, dass die NER eine große Anzahl an strukturell sehr unterschiedlichen Substraten erkennen und reparieren kann. Die Enden der DNA werden aufgeschmolzen und nur ein 13mer Erkennungsmotiv mit dem Schaden in zentraler Position, durch den eine pseudo C2-Symmetrieachse läuft, bleibt intakt. Den erhaltenen Kristallstrukturen ist gemein, dass die DNA geknickt vorliegt (ca. 70° - 78°). Aus der C8-AAF-dG Struktur wird ersichtlich, dass dG mit AAF eine Ebene bildet, welche eine große Oberfläche für π stacking Interaktionen mit den angrenzenden Basenpaaren bietet, wobei deren Watson-Crick Basenpaarung intakt bleibt. Die Hypothese, dass diese Interaktionen zur Stabilisierung des DNA-Knicks beitragen, wurde durch die neuen Strukturen gefestigt., This PhD-thesis deals with aryl- and alkylmodified DNA-bases. The synthesis of phosphoramidites of bulky DNA lesions and their incorporation into oligonucleotide strands for the investigation of the nucleotide excision repair (NER) mechanism was carried out as well as the synthesis of isotopically labelled standards of methylated DNA bases for their quantification in different cells and tissues. The activation or repression of certain genes at specific times in mammals, is often accomplished by methylation of 2’ deoxycytidine (dC) to 5 methyl-2’ deoxycytidine (m5dC) in promoter regions using S-adenosylmethionine (SAM) as a cofactor for DNA-methyltransferases. In the Carell group feeding experiments are carried out, in which [13CD3]-methionine is added to the medium of murine embryonic stem cells (mESC). It is metabolized to SAM, leading eventually to the formation of [13CD3]-m5dC. Because of the isotopic label it is possible to track the fate of the methyl group. In the course of this work 5-[D3]-methyl-2‘ deoxy-[6 D, 1,3-15N2]-cytidine ([D4, 15N2]-m5dC) was synthesized as an internal m5dC[+6] standard for the quantification of isotope-labelled m5dC. Furthermore, 4-methyl-2‘ deoxy-[1,3-15N2]-cytidine ([15N2]-m4dC) and 6-[D3]-methyl-2’ deoxyadenosine ([D3]-m6dA) were synthesized as standards for the quantification of m4dC and m6dA in different organisms, as well as non-labelled m6dA for the construction of an internal calibration curve. These two modifications have been known in bacteria for a long time and in addition, in 2015, m6dA was detected in different eukaryotic organisms. With the standards synthesized here, we were able to develop an ultrasensitive UHPLC-MS method (Ultra High-Performance Liquid Chromatography coupled with mass spectrometry), which allows detection of very small amounts of these methylated bases in DNA. m4dC was detected only in bacteria while m6dA was found in the green algae Chlamydomonas reinhardtii as well, which was used as a positive control. In contrast to the literature, we could not detect m6dA neither in mESC nor in tissues of adult mice. These findings put the numerous publications on the detection of this modification in different vertebrates into perspective. The other part of this thesis focuses on aryl DNA-bases. The bulky DNA adducts between 2‘ deoxyguanosine (dG) and aromatic amides or amines are recognized and repaired by the NER machinery. The proteins of the Xeroderma Pigmentosum (XP) family and especially XPA are the main proteins involved in the recognition and repair of these lesions. In 2015, in the Carell group, the crystal structure of double stranded DNA (dsDNA) – damaged with acetylaminofluorene (AAF) in the C8 position of dG – in complex with Rad14, the yeast homologue of XPA, was obtained. This structure indicates a potential role of XPA/Rad14 during damage recognition, in which the bendability of the DNA strand is tested. During this work, DNA strands with further C8-dG adducts were synthesized, which differed in the size of the aromatic ring system. In addition, the phosphoramidites of N2 dG-adducts were synthesized which differed regarding the size of the aromatic residue, as well as the phosphoramidite of the C8-AAF adduct with 2‘ deoxyadenosine (dA). The DNA strands containing these adducts were successfully synthesized. Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) confirmed a higher affinity of XPA to all the synthesized damaged DNA strands compared to undamaged dsDNA. For the dsDNA that contained C8-adducts as well as for the double strand containing the N2 acetylaminonaphthalene(AAN)-dG adduct, crystal structures with Rad14 were obtained. Analogously to the C8-AAF-dG structure, in all these structures two Rad14 molecules bind the DNA, contacting mainly the phosphate backbone in a sequence independent way via a β-hairpin. No contact with the damaged base itself is observed which is consistent with the fact that the NER machinery can recognize and repair a large number of structurally very different substrates. The ends of the DNA doublestrand are opened leaving only a 13mer recognition motif around the centre intact. A pseudo C2 symmetry axis runs through the damaged site. In all the obtained crystal structures, the DNA is kinked by about 70° to 78°. In the C8-AAF-dG structure, the dG is in plane with the AAF residue providing a large surface for π stacking interactions with the adjacent base pairs whose Watson-Crick base pairing remains intact. The hypothesis that these interactions stabilize the DNA kink is supported by the new structures.
DNA, NER, XPA, m6dA, m4dC
Ebert, Charlotte
2017
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Ebert, Charlotte (2017): Synthese und Untersuchung kohlenstoffsubstituierter DNA-Basen. Dissertation, LMU München: Faculty of Chemistry and Pharmacy
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Abstract

Diese Promotionsarbeit befasst sich mit aryl- und alkylmodifizierten DNA-Basen. Zum einen wurden die Phosphoramidite arylsubstituierter DNA-Basen für die Untersuchung des Mechanismus der Nukleotidexzisionsreparatur (NER) synthetisiert und in DNA-Stränge eingebaut. Zum anderen wurden isotopenmarkierte Standards methylierter DNA-Basen für deren Massenspektrometrie-basierte Quantifizierung in unterschiedlichen Zellen und Geweben hergestellt. Die Aktivierung bzw. Stilllegung bestimmter Gene zu bestimmten Zeiten, wird in Säugetieren unter anderem durch die Methylierung von 2‘ Desoxycytidin (dC) zu 5-Methyl-2‘ desoxycytidin (m5dC) in der Promotorenregion des jeweiligen Gens durch DNA-Methyltransferasen mit S-Adenosylmethionin (SAM) als Cofaktor bewerkstelligt. Im Arbeitskreis Carell werden Fütterungsexperimente durchgeführt, bei denen dem Medium embryonaler Stammzellen der Maus (mES-Zellen) [13CD3]-Methionin zugefügt wird. Dieses wird zu SAM verstoffwechselt, sodass die deuterierte, 13C-markierte Methylgruppe letztendlich [13CD3]-m5dC generiert. Dank der Isotopenmarkierung lässt sich das Schicksal der Methylgruppe verfolgen. Im Zuge dieser Arbeit wurde 5-[D3]-Methyl-2‘-desoxy-[6 D, 1,3 15N2]-cytidin ([D4, 15N2]-m5dC) als interner m5dC[+6] Standard für die Quantifizierung des schweren m5dC synthetisiert. Des Weiteren wurden 4-Methyl-2‘ desoxy-[1,3-15N2]-cytidin ([15N2]-m4dC) und 6-[D3]-Methyl-2’ desoxyadenosin ([D3]-m6dA) als Standards für die Quantifizierung von m4dC und m6dA in unterschiedlichen Organismen, sowie unmarkiertes m6dA für die Erstellung einer Eichgeraden synthetisiert. Diese beiden Modifikationen sind seit langem in Bakterien bekannt und 2015 konnte m6dA zusätzlich in verschiedenen eukaryotischen Organismen nachgewiesen werden. Durch die hier synthetisierten Standards konnten wir eine ultrasensitive UHPLC-MS-Methode (Ultra High Performance Liquid Chromatography gekoppelt mit Massenspektrometrie) entwickeln, mit der auch der Nachweis kleinster Mengen dieser methylierten Basen in der DNA möglich war. m4dC konnte einzig in Bakterien nachgewiesen werden, m6dA zusätzlich noch in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, welche als Positivkontrolle verwendet wurde. Anders als in der Literatur beschrieben, konnten wir jedoch kein m6dA in mES-Zellen oder im Gewebe erwachsener Mäuse detektieren. Dies relativiert die zahlreichen Berichte über den Nachweis dieser Modifikation in den unterschiedlichsten Wirbeltieren. Der andere Teil dieser Promotionsarbeit befasst sich mit arylsubstituierten DNA-Basen. Die sperrigen DNA-Addukte zwischen 2‘ Desoxyguanosin (dG) und aromatischen Amiden bzw. Aminen werden durch die NER erkannt und repariert. Die Proteine der Xeroderma Pigmentosum (XP) Familie und insbesondere das XPA-Protein sind maßgeblich an der Erkennung und an der Reparatur dieser Schäden beteiligt. 2015 konnte im Arbeitskreis Carell die Kristallstruktur mit Acetylaminofluoren (AAF) in C8 Position von dG geschädigter DNA und Rad14, dem Hefehomolog von XPA, erhalten werden. Diese Struktur weist auf eine Rolle von XPA/Rad14 in der Schadenserkennung hin, wobei die DNA auf ihre Biegsamkeit überprüft wird. Im Zuge dieser Arbeit wurden DNA-Stränge mit weiteren C8-dG-Addukten hergestellt, welche sich in der Größe des aromatischen Rests unterschieden. Zusätzlich wurden die Phosphoramidite verschiedener N2 dG-Addukte synthetisiert, welche ebenfalls unterschiedlich große aromatische Reste besaßen, ebenso wie das Phosphoramidit des C8-AAF-Addukts mit 2‘ Desoxyadenosin (dA). Auch die Synthese von DNA-Strängen, welche diese Addukte enthielten, war erfolgreich. EMSA-Studien (Electrophoretic Mobility Shift Assay) konnten eine höhere Affinität von XPA für sämtliche synthetisierte geschädigte doppelsträngige DNA im Vergleich zu ungeschädigter DNA bestätigen. Für alle Doppelstränge, die C8-Addukte enthielten, sowie für den Doppelstrang mit N2 Acetylaminonaphthalin(AAN)-dG als Schaden, konnten Kristallstrukturen mit Rad14 erhalten werden. Analog zur C8-AAF-dG Struktur binden in all diesen Strukturen immer zwei Rad14-Moleküle an die DNA, wobei der Kontakt hauptsächlich über die β Schleife mit dem Phosphatrückgrat stattfindet, also sequenzunabhängig ist. Hierbei kommt es zu keinem direkten Kontakt mit dem Schaden, was mit der Tatsache im Einklang ist, dass die NER eine große Anzahl an strukturell sehr unterschiedlichen Substraten erkennen und reparieren kann. Die Enden der DNA werden aufgeschmolzen und nur ein 13mer Erkennungsmotiv mit dem Schaden in zentraler Position, durch den eine pseudo C2-Symmetrieachse läuft, bleibt intakt. Den erhaltenen Kristallstrukturen ist gemein, dass die DNA geknickt vorliegt (ca. 70° - 78°). Aus der C8-AAF-dG Struktur wird ersichtlich, dass dG mit AAF eine Ebene bildet, welche eine große Oberfläche für π stacking Interaktionen mit den angrenzenden Basenpaaren bietet, wobei deren Watson-Crick Basenpaarung intakt bleibt. Die Hypothese, dass diese Interaktionen zur Stabilisierung des DNA-Knicks beitragen, wurde durch die neuen Strukturen gefestigt.

Abstract

This PhD-thesis deals with aryl- and alkylmodified DNA-bases. The synthesis of phosphoramidites of bulky DNA lesions and their incorporation into oligonucleotide strands for the investigation of the nucleotide excision repair (NER) mechanism was carried out as well as the synthesis of isotopically labelled standards of methylated DNA bases for their quantification in different cells and tissues. The activation or repression of certain genes at specific times in mammals, is often accomplished by methylation of 2’ deoxycytidine (dC) to 5 methyl-2’ deoxycytidine (m5dC) in promoter regions using S-adenosylmethionine (SAM) as a cofactor for DNA-methyltransferases. In the Carell group feeding experiments are carried out, in which [13CD3]-methionine is added to the medium of murine embryonic stem cells (mESC). It is metabolized to SAM, leading eventually to the formation of [13CD3]-m5dC. Because of the isotopic label it is possible to track the fate of the methyl group. In the course of this work 5-[D3]-methyl-2‘ deoxy-[6 D, 1,3-15N2]-cytidine ([D4, 15N2]-m5dC) was synthesized as an internal m5dC[+6] standard for the quantification of isotope-labelled m5dC. Furthermore, 4-methyl-2‘ deoxy-[1,3-15N2]-cytidine ([15N2]-m4dC) and 6-[D3]-methyl-2’ deoxyadenosine ([D3]-m6dA) were synthesized as standards for the quantification of m4dC and m6dA in different organisms, as well as non-labelled m6dA for the construction of an internal calibration curve. These two modifications have been known in bacteria for a long time and in addition, in 2015, m6dA was detected in different eukaryotic organisms. With the standards synthesized here, we were able to develop an ultrasensitive UHPLC-MS method (Ultra High-Performance Liquid Chromatography coupled with mass spectrometry), which allows detection of very small amounts of these methylated bases in DNA. m4dC was detected only in bacteria while m6dA was found in the green algae Chlamydomonas reinhardtii as well, which was used as a positive control. In contrast to the literature, we could not detect m6dA neither in mESC nor in tissues of adult mice. These findings put the numerous publications on the detection of this modification in different vertebrates into perspective. The other part of this thesis focuses on aryl DNA-bases. The bulky DNA adducts between 2‘ deoxyguanosine (dG) and aromatic amides or amines are recognized and repaired by the NER machinery. The proteins of the Xeroderma Pigmentosum (XP) family and especially XPA are the main proteins involved in the recognition and repair of these lesions. In 2015, in the Carell group, the crystal structure of double stranded DNA (dsDNA) – damaged with acetylaminofluorene (AAF) in the C8 position of dG – in complex with Rad14, the yeast homologue of XPA, was obtained. This structure indicates a potential role of XPA/Rad14 during damage recognition, in which the bendability of the DNA strand is tested. During this work, DNA strands with further C8-dG adducts were synthesized, which differed in the size of the aromatic ring system. In addition, the phosphoramidites of N2 dG-adducts were synthesized which differed regarding the size of the aromatic residue, as well as the phosphoramidite of the C8-AAF adduct with 2‘ deoxyadenosine (dA). The DNA strands containing these adducts were successfully synthesized. Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) confirmed a higher affinity of XPA to all the synthesized damaged DNA strands compared to undamaged dsDNA. For the dsDNA that contained C8-adducts as well as for the double strand containing the N2 acetylaminonaphthalene(AAN)-dG adduct, crystal structures with Rad14 were obtained. Analogously to the C8-AAF-dG structure, in all these structures two Rad14 molecules bind the DNA, contacting mainly the phosphate backbone in a sequence independent way via a β-hairpin. No contact with the damaged base itself is observed which is consistent with the fact that the NER machinery can recognize and repair a large number of structurally very different substrates. The ends of the DNA doublestrand are opened leaving only a 13mer recognition motif around the centre intact. A pseudo C2 symmetry axis runs through the damaged site. In all the obtained crystal structures, the DNA is kinked by about 70° to 78°. In the C8-AAF-dG structure, the dG is in plane with the AAF residue providing a large surface for π stacking interactions with the adjacent base pairs whose Watson-Crick base pairing remains intact. The hypothesis that these interactions stabilize the DNA kink is supported by the new structures.