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Bestimmung des MDR1 (Multidrug resistance 1)-Genstatus beim Hund mittels allel-spezifischer PCR und allel-spezifischer Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP)
Bestimmung des MDR1 (Multidrug resistance 1)-Genstatus beim Hund mittels allel-spezifischer PCR und allel-spezifischer Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP)
Der Multidrug resistance 1 (MDR1)-Gendefekt stellt eine Mutation dar, welche beim Hund durch den Verlust von vier Basenpaaren im vierten Exon des MDR1-Gens gekennzeichnet ist (MEALEY et al., 2001). Einige Hunderassen und Mischlinge, vor allem Collies und andere Hütehunde, sind von dieser autosomal rezessiv vererbten Mutation bis zu 52 % homozygot betroffen (TAPPIN et al., 2012). Sie können kein funktionierendes P-Glykoprotein (P-Gp) bilden, welches als Wirkstofftransporter in der Blut-Hirn-Schranke die Anreicherung von Arzneimitteln in neuronalem Gewebe verhindert. So entsteht eine Unverträglichkeit und Überreaktion auf in der Veterinärmedizin häufig verwendete Arzneimittel wie Ivermectin. Es treten vor allem neurologische Symptome wie Ataxie, Bewusstlosigkeit und Krämpfe auf. Bei schwerer Intoxikation kommt es zu Koma und Tod des Tieres (PULLIAM et al., 1985; MEALEY et al., 2001). In den Zuchtverbänden stark betroffener Rassen werden MDR1-Gentests als Voraussetzung für die Zuchtzulassung häufig schon bei den Welpen durchgeführt. Bei anderen Hunden wie Mischlingen geben erst Reaktionen auf ein Medikament Hinweise auf den Gendefekt. Bei Hunden mit neurologischen Symptomen unklarer Ätiologie ist eine unverzügliche Diagnosestellung wichtig, um die Therapie anzupassen und eine Prognose stellen zu können. Um als Veterinärmediziner einschätzen zu können, ob einem Patienten das Arzneimittel der Wahl verabreicht werden darf, ist eine schnelle, in der Praxis durchführbare Nachweisemethode für den MDR1-Gendefekt wünschenswert. Keine der bisher veröffentlichten Methoden zur Unterscheidung des Genstatus stellt einen kostengünstigen und zugleich schnellen Nachweis dar, welcher ohne aufwendige Laborausstattung durchzuführen wäre. Abhilfe könnte hier die Methode der Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) schaffen. Im Bereich des Erregernachweises wird sie heute bereits als Point-of-Care (POC)-Test eingesetzt, da die Reaktion schnell abläuft und in einfachen, kleinen Geräten durchgeführt werden kann (PARIDA et al., 2008; CRAW & BALACHANDRAN, 2012). Ziel der vorliegenden Arbeit war die schnelle und eindeutige Bestimmung des MDR1-Genstatus beim Hund. Dazu wurden nach der Extraktion von Desoxyribonukleinsäure (DNA) aus Backenschleimhauttupfern von Hunden mit bekanntem Genstatus Reaktionen als allel-spezifische Polymerase-Kettenreaktion (AS-PCR) und als allel-spezifische LAMP (AS-LAMP) angesetzt. Außerdem wurden verschiedene Detektionsmethoden getestet, um die Zeit von der Probenentnahme bis zum Testergebnis zu verkürzen. Eine eindeutige Genotyp-Zuordnung konnte mit diesen Methoden in etwa 60 Minuten erreicht werden.
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Stiedl, Cathrin
2017
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Stiedl, Cathrin (2017): Bestimmung des MDR1 (Multidrug resistance 1)-Genstatus beim Hund mittels allel-spezifischer PCR und allel-spezifischer Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP). Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Der Multidrug resistance 1 (MDR1)-Gendefekt stellt eine Mutation dar, welche beim Hund durch den Verlust von vier Basenpaaren im vierten Exon des MDR1-Gens gekennzeichnet ist (MEALEY et al., 2001). Einige Hunderassen und Mischlinge, vor allem Collies und andere Hütehunde, sind von dieser autosomal rezessiv vererbten Mutation bis zu 52 % homozygot betroffen (TAPPIN et al., 2012). Sie können kein funktionierendes P-Glykoprotein (P-Gp) bilden, welches als Wirkstofftransporter in der Blut-Hirn-Schranke die Anreicherung von Arzneimitteln in neuronalem Gewebe verhindert. So entsteht eine Unverträglichkeit und Überreaktion auf in der Veterinärmedizin häufig verwendete Arzneimittel wie Ivermectin. Es treten vor allem neurologische Symptome wie Ataxie, Bewusstlosigkeit und Krämpfe auf. Bei schwerer Intoxikation kommt es zu Koma und Tod des Tieres (PULLIAM et al., 1985; MEALEY et al., 2001). In den Zuchtverbänden stark betroffener Rassen werden MDR1-Gentests als Voraussetzung für die Zuchtzulassung häufig schon bei den Welpen durchgeführt. Bei anderen Hunden wie Mischlingen geben erst Reaktionen auf ein Medikament Hinweise auf den Gendefekt. Bei Hunden mit neurologischen Symptomen unklarer Ätiologie ist eine unverzügliche Diagnosestellung wichtig, um die Therapie anzupassen und eine Prognose stellen zu können. Um als Veterinärmediziner einschätzen zu können, ob einem Patienten das Arzneimittel der Wahl verabreicht werden darf, ist eine schnelle, in der Praxis durchführbare Nachweisemethode für den MDR1-Gendefekt wünschenswert. Keine der bisher veröffentlichten Methoden zur Unterscheidung des Genstatus stellt einen kostengünstigen und zugleich schnellen Nachweis dar, welcher ohne aufwendige Laborausstattung durchzuführen wäre. Abhilfe könnte hier die Methode der Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) schaffen. Im Bereich des Erregernachweises wird sie heute bereits als Point-of-Care (POC)-Test eingesetzt, da die Reaktion schnell abläuft und in einfachen, kleinen Geräten durchgeführt werden kann (PARIDA et al., 2008; CRAW & BALACHANDRAN, 2012). Ziel der vorliegenden Arbeit war die schnelle und eindeutige Bestimmung des MDR1-Genstatus beim Hund. Dazu wurden nach der Extraktion von Desoxyribonukleinsäure (DNA) aus Backenschleimhauttupfern von Hunden mit bekanntem Genstatus Reaktionen als allel-spezifische Polymerase-Kettenreaktion (AS-PCR) und als allel-spezifische LAMP (AS-LAMP) angesetzt. Außerdem wurden verschiedene Detektionsmethoden getestet, um die Zeit von der Probenentnahme bis zum Testergebnis zu verkürzen. Eine eindeutige Genotyp-Zuordnung konnte mit diesen Methoden in etwa 60 Minuten erreicht werden.