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Generierung genetisch modifizierter Hühnermodelle für die immunologische Forschung
Generierung genetisch modifizierter Hühnermodelle für die immunologische Forschung
Bei Säugern und Vögeln werden anhand ihres T-Zell-Rezeptors zwei verschiedene T-Zell-Populationen unterschieden: die T-Zellen und die T-Zellen. Die Bedeutung von  T-Zellen in der Immunabwehr ist bereits intensiv erforscht. Dagegen scheinen T-Zellen von T-Zellen verschiedene Aufgaben zu erfüllen, die im Einzelnen noch nicht hinreichend bekannt sind. Hinzu kommt, dass Hühner sowie andere landwirtschaftliche Nutztiere im Vergleich zu Maus und Mensch einen wesentlich höheren Anteil an T-Zellen im peripheren Blut haben. Daher lassen sich Ergebnisse der Forschung an Mensch und Maus vermutlich nicht unmittelbar auf das Huhn übertragen. Für die Erforschung komplexer immunologischer Fragestellungen ist die Verfügbarkeit passender, oft genetisch modifizierter Tiermodelle von großer Bedeutung. Mäuse werden häufig als Modellorganismen eingesetzt, um zu ermitteln welche Rolle bestimmte Zellen bei der Immunabwehr oder bei Krankheiten einnehmen. Durch jahrzehntelange Forschung unter Verwendung von Mäuse-Stammzell-Technologien ist die reverse Genetik im Mäusemodell sehr gut etabliert. Bis vor kurzem waren diese Methoden nicht in Hühnern anwendbar. Erst die technischen Fortschritte in den letzten Jahren, wie die Kultivierung und Transfektion primordialer Keimzellen (PGCs), machten es möglich, die reverse Genetik auch für die Erforschung von Genfunktionen beim Huhn zu nutzen. Ziel dieser Arbeit war es, die Methoden zur genetischen Modifikation in PGCs zu verwenden und zu verbessern, indem diese Zellen isoliert, kultiviert und transfiziert wurden. Anschließend wurden die PGCs zurück in Embryonen transplantiert, um eine ubiquitär mCherry exprimierende Hühnerlinie sowie eine T-Zell defiziente Hühnerlinie zu generieren. Des Weiteren sollte das Potential des CRISPR/Cas9-Systems zum Einsatz in primordialen Keimzellen getestet werden und zur Etablierung einer T-Zell defizienten Hühnerlinie eingesetzt werden. Die Versuche wurden in CB PGCs mit Inzuchthintergrund sowie LSL PGCs mit Auszuchthintergrund durchgeführt. Es wurden erfolgreich PGC Linien unterschiedlichen genetischen Hintergrunds isoliert, kultiviert und anschließend zur spezifischen Modifikation des C-Gens verwendet. Hierfür wurde klassische homologe Rekombination oder eine Kombination mit dem CRISPR/Cas9-System eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass das CRISPR/Cas9-System in der Lage ist, spezifische Doppelstrangbrüche in das Genom von Hühnerzellen wie DT40 Zellen und PGCs einzufügen. Durch Kombination des CRISPR/Cas9-Systems mit Targeting Vektoren zur homologen Rekombination konnten definierte genomische Veränderungen mit hoher Effizienz vorgenommen werden. Diese Methode erlaubt das Vornehmen spezifischer Veränderungen am Hühnergenom sowie das Einfügen von Fremdgenen am gewünschten Lokus. PGCs mit auf diese Weise vorgenommenen Modifikationen wurden zur Generierung transgener Hühner verwendet. Dieses Vorgehen hat das Potential, zukünftig die Erstellung genetisch modifizierter Hühnermodelle zu vereinfachen. Um eine T-Zell defiziente Hühnerlinie zu generieren, wurde das nur einmalig im Hühnergenom beschriebene C-Gen deletiert. Hierfür wurde ein Targeting Vektor zur homologen Rekombination kloniert. Durch Kombination mit für das C-Gen spezifischen CRISPR/Cas9-Konstrukten konnte eine Steigerung der Targetingeffizienz in isogenen und nicht-isogenen PGC Linien erreicht werden. Klonal expandierte C KO PGC Linien wurden zur Generierung von Keimbahn-Chimären verwendet. Von CB PGC C KO Keimbahn-Chimären konnte keine Keimbahn-Transmission nachgewiesen werden. Mehrere LSL PGC C KO Chimären zeigten Keimbahn-Transmission und erzeugten heterozygote C-KO+/- Küken. Weitere Analysen nach Etablierung homozygoter C KO-/- Tiere sind nötig, um den gewünschten Phänotyp zu bestätigen. Zudem wurde eine Hühnerlinie mit ubiquitärer mCherry-Expression generiert, indem ein mCherry-attB-Konstrukt kloniert und gemeinsam mit einem phiC31 Integrase Plasmid in PGCs transfiziert wurde. mCherry-positive PGC Linien wurden zur Generierung von Keimbahn-Chimären verwendet. CB PGC mCherry Chimären zeigten eine sehr geringe Keimbahn-Transmission und es war mit den in dieser Arbeit verwendeten Methoden nicht möglich, mCherry CB Nachzucht zu erzeugen. Von LSL PGC mCherry Chimären konnte Keimbahn-Transmission nachgewiesen werden. Nachfolgend schlüpften heterozygote mCherry+/- Küken. Diese Linie kann nun für adoptive Transferexperimente und in vivo imaging Verfahren eingesetzt werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das CRISPR/Cas9-System zur Modifikation des Hühnergenoms in PGCs geeignet ist. Die Targetingeffizienz von Vektoren zur homologen Rekombination konnte durch Kombination mit spezifischen CRISPR/Cas9-Konstrukten gesteigert werden. Es ist gelungen, heterozygote mCherry+/- sowie heterozygote C KO+/- Hühner zu erzeugen, die nun für die Erforschung immunologischer Fragestellungen am Huhn eingesetzt werden können., In mammals and birds, two distinct T-cell lines can be discriminated according to their T cell-receptor usage: the T cells and the T-cells. There has been intense research into the role of T-cells in the immune defense. However, T-cells seem to have distinct functions which are presently not fully understood. Furthermore, in chickens and other livestock T-cells are much more frequent in the peripheral blood compared to human and mouse. Therefore, research in humans and mice may not be directly transferable to chicken. To carry out research into complex immunologic topics, it is important to have access to suitable, often genetically modified animal models. Mice are frequently used as model organism to better understand the role of cells and cellular factors in immunity and disease. Reverse genetics are well established in mouse models, due to decades of research using mouse stem cell technologies. Until recently, these methods were not available in chickens. Technological improvements during the last couple of years such as culture and transfection of primordial germ cells (PGCs) have made it possible to use reverse genetic for investigation on gene functions in chickens. The aim of this study was to use and advance the methods of genetic alteration in PGCs by isolating, culturing and transfecting followed by transplanting these cells back into embryos, in order to generate a chicken line with ubiquitous mCherry expression and a chicken line lacking T-cells. Furthermore, the potential of the CRISPR/Cas9-system to edit genes in PGCs was investigated and used to establish a T-cell deficient chicken line. Experiments were carried out in inbred CB PGCs and LSL PGCs with an outbred genetic background. PGC lines from different genetic backgrounds were successfully isolated, cultured and used to specifically modify the C-gene by traditional homologous recombination or by homologous recombination in combination with the CRISPR/Cas9-system. It was shown that the CRISPR/Cas9-system is able to introduce specific double-stranded breaks in the genome of chicken cells like DT40 and PGCs. By combining CRISPR/Cas9-system with targeting vectors for homologous recombination, defined genomic modifications were introduced with high efficiency. This method allows to make specific changes to the chicken genome or to knock-in genes into the desired locus. This method has the potential to facilitate the generation of genetically modified chicken models in the future. To establish a T-cell deficient chicken line, the single known C-gene was targeted in the chicken genome. A targeting vector for homologous recombination was cloned. By combination with C-gene specific CRISPR/Cas9-constructs, targeting efficiency was increased in isogenic and non-isogenic PGC lines. Clonally expanded C KO PGC lines were then used to generate germline chimeras. However, no germline transmission was detected from CB PGC C KO germline chimeras. On the other hand, several LSL PGC C KO chimeras showed germline transmission and produced heterozygous C KO+/- offspring. After breeding of homozygous C KO-/- chickens, further analyses can be carried out to prove the desired phenotype. A chicken line with ubiquitous mCherry expression was generated by the construction of a mCherry-attB-construct that was cotransfected with a phiC31 plasmid in PGCs. mCherry-positive PGC lines were then used for the generation of germline chimeras. CB PGC mCherry chimeras had very low germline transmission efficiency and with the methods used in this study, no mCherry CB offspring was obtained. Germline transmission was shown for LSL PGC mCherry chimeras, heterozygous mCherry+/- offspring hatched subsequently and will be become a useful tool for adoptive transfer studies and in vivo imaging. This study has shown that the CRISPR/Cas9-system can be used to modify the chicken genome in PGCs. Targeting efficiency for homologous recombination was increased by combinating with specific CRISPR/Cas9-constructs. Heterozygous mCherry+/- chickens and heterozygous C KO+/- chickens were successfully generated and will be used to address immunological questions in the chicken.
chicken, gamma delta T cells, CRISPR/Cas9, transgenic
Aumann, Dorothea
2017
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Aumann, Dorothea (2017): Generierung genetisch modifizierter Hühnermodelle für die immunologische Forschung. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Bei Säugern und Vögeln werden anhand ihres T-Zell-Rezeptors zwei verschiedene T-Zell-Populationen unterschieden: die T-Zellen und die T-Zellen. Die Bedeutung von  T-Zellen in der Immunabwehr ist bereits intensiv erforscht. Dagegen scheinen T-Zellen von T-Zellen verschiedene Aufgaben zu erfüllen, die im Einzelnen noch nicht hinreichend bekannt sind. Hinzu kommt, dass Hühner sowie andere landwirtschaftliche Nutztiere im Vergleich zu Maus und Mensch einen wesentlich höheren Anteil an T-Zellen im peripheren Blut haben. Daher lassen sich Ergebnisse der Forschung an Mensch und Maus vermutlich nicht unmittelbar auf das Huhn übertragen. Für die Erforschung komplexer immunologischer Fragestellungen ist die Verfügbarkeit passender, oft genetisch modifizierter Tiermodelle von großer Bedeutung. Mäuse werden häufig als Modellorganismen eingesetzt, um zu ermitteln welche Rolle bestimmte Zellen bei der Immunabwehr oder bei Krankheiten einnehmen. Durch jahrzehntelange Forschung unter Verwendung von Mäuse-Stammzell-Technologien ist die reverse Genetik im Mäusemodell sehr gut etabliert. Bis vor kurzem waren diese Methoden nicht in Hühnern anwendbar. Erst die technischen Fortschritte in den letzten Jahren, wie die Kultivierung und Transfektion primordialer Keimzellen (PGCs), machten es möglich, die reverse Genetik auch für die Erforschung von Genfunktionen beim Huhn zu nutzen. Ziel dieser Arbeit war es, die Methoden zur genetischen Modifikation in PGCs zu verwenden und zu verbessern, indem diese Zellen isoliert, kultiviert und transfiziert wurden. Anschließend wurden die PGCs zurück in Embryonen transplantiert, um eine ubiquitär mCherry exprimierende Hühnerlinie sowie eine T-Zell defiziente Hühnerlinie zu generieren. Des Weiteren sollte das Potential des CRISPR/Cas9-Systems zum Einsatz in primordialen Keimzellen getestet werden und zur Etablierung einer T-Zell defizienten Hühnerlinie eingesetzt werden. Die Versuche wurden in CB PGCs mit Inzuchthintergrund sowie LSL PGCs mit Auszuchthintergrund durchgeführt. Es wurden erfolgreich PGC Linien unterschiedlichen genetischen Hintergrunds isoliert, kultiviert und anschließend zur spezifischen Modifikation des C-Gens verwendet. Hierfür wurde klassische homologe Rekombination oder eine Kombination mit dem CRISPR/Cas9-System eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass das CRISPR/Cas9-System in der Lage ist, spezifische Doppelstrangbrüche in das Genom von Hühnerzellen wie DT40 Zellen und PGCs einzufügen. Durch Kombination des CRISPR/Cas9-Systems mit Targeting Vektoren zur homologen Rekombination konnten definierte genomische Veränderungen mit hoher Effizienz vorgenommen werden. Diese Methode erlaubt das Vornehmen spezifischer Veränderungen am Hühnergenom sowie das Einfügen von Fremdgenen am gewünschten Lokus. PGCs mit auf diese Weise vorgenommenen Modifikationen wurden zur Generierung transgener Hühner verwendet. Dieses Vorgehen hat das Potential, zukünftig die Erstellung genetisch modifizierter Hühnermodelle zu vereinfachen. Um eine T-Zell defiziente Hühnerlinie zu generieren, wurde das nur einmalig im Hühnergenom beschriebene C-Gen deletiert. Hierfür wurde ein Targeting Vektor zur homologen Rekombination kloniert. Durch Kombination mit für das C-Gen spezifischen CRISPR/Cas9-Konstrukten konnte eine Steigerung der Targetingeffizienz in isogenen und nicht-isogenen PGC Linien erreicht werden. Klonal expandierte C KO PGC Linien wurden zur Generierung von Keimbahn-Chimären verwendet. Von CB PGC C KO Keimbahn-Chimären konnte keine Keimbahn-Transmission nachgewiesen werden. Mehrere LSL PGC C KO Chimären zeigten Keimbahn-Transmission und erzeugten heterozygote C-KO+/- Küken. Weitere Analysen nach Etablierung homozygoter C KO-/- Tiere sind nötig, um den gewünschten Phänotyp zu bestätigen. Zudem wurde eine Hühnerlinie mit ubiquitärer mCherry-Expression generiert, indem ein mCherry-attB-Konstrukt kloniert und gemeinsam mit einem phiC31 Integrase Plasmid in PGCs transfiziert wurde. mCherry-positive PGC Linien wurden zur Generierung von Keimbahn-Chimären verwendet. CB PGC mCherry Chimären zeigten eine sehr geringe Keimbahn-Transmission und es war mit den in dieser Arbeit verwendeten Methoden nicht möglich, mCherry CB Nachzucht zu erzeugen. Von LSL PGC mCherry Chimären konnte Keimbahn-Transmission nachgewiesen werden. Nachfolgend schlüpften heterozygote mCherry+/- Küken. Diese Linie kann nun für adoptive Transferexperimente und in vivo imaging Verfahren eingesetzt werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das CRISPR/Cas9-System zur Modifikation des Hühnergenoms in PGCs geeignet ist. Die Targetingeffizienz von Vektoren zur homologen Rekombination konnte durch Kombination mit spezifischen CRISPR/Cas9-Konstrukten gesteigert werden. Es ist gelungen, heterozygote mCherry+/- sowie heterozygote C KO+/- Hühner zu erzeugen, die nun für die Erforschung immunologischer Fragestellungen am Huhn eingesetzt werden können.

Abstract

In mammals and birds, two distinct T-cell lines can be discriminated according to their T cell-receptor usage: the T cells and the T-cells. There has been intense research into the role of T-cells in the immune defense. However, T-cells seem to have distinct functions which are presently not fully understood. Furthermore, in chickens and other livestock T-cells are much more frequent in the peripheral blood compared to human and mouse. Therefore, research in humans and mice may not be directly transferable to chicken. To carry out research into complex immunologic topics, it is important to have access to suitable, often genetically modified animal models. Mice are frequently used as model organism to better understand the role of cells and cellular factors in immunity and disease. Reverse genetics are well established in mouse models, due to decades of research using mouse stem cell technologies. Until recently, these methods were not available in chickens. Technological improvements during the last couple of years such as culture and transfection of primordial germ cells (PGCs) have made it possible to use reverse genetic for investigation on gene functions in chickens. The aim of this study was to use and advance the methods of genetic alteration in PGCs by isolating, culturing and transfecting followed by transplanting these cells back into embryos, in order to generate a chicken line with ubiquitous mCherry expression and a chicken line lacking T-cells. Furthermore, the potential of the CRISPR/Cas9-system to edit genes in PGCs was investigated and used to establish a T-cell deficient chicken line. Experiments were carried out in inbred CB PGCs and LSL PGCs with an outbred genetic background. PGC lines from different genetic backgrounds were successfully isolated, cultured and used to specifically modify the C-gene by traditional homologous recombination or by homologous recombination in combination with the CRISPR/Cas9-system. It was shown that the CRISPR/Cas9-system is able to introduce specific double-stranded breaks in the genome of chicken cells like DT40 and PGCs. By combining CRISPR/Cas9-system with targeting vectors for homologous recombination, defined genomic modifications were introduced with high efficiency. This method allows to make specific changes to the chicken genome or to knock-in genes into the desired locus. This method has the potential to facilitate the generation of genetically modified chicken models in the future. To establish a T-cell deficient chicken line, the single known C-gene was targeted in the chicken genome. A targeting vector for homologous recombination was cloned. By combination with C-gene specific CRISPR/Cas9-constructs, targeting efficiency was increased in isogenic and non-isogenic PGC lines. Clonally expanded C KO PGC lines were then used to generate germline chimeras. However, no germline transmission was detected from CB PGC C KO germline chimeras. On the other hand, several LSL PGC C KO chimeras showed germline transmission and produced heterozygous C KO+/- offspring. After breeding of homozygous C KO-/- chickens, further analyses can be carried out to prove the desired phenotype. A chicken line with ubiquitous mCherry expression was generated by the construction of a mCherry-attB-construct that was cotransfected with a phiC31 plasmid in PGCs. mCherry-positive PGC lines were then used for the generation of germline chimeras. CB PGC mCherry chimeras had very low germline transmission efficiency and with the methods used in this study, no mCherry CB offspring was obtained. Germline transmission was shown for LSL PGC mCherry chimeras, heterozygous mCherry+/- offspring hatched subsequently and will be become a useful tool for adoptive transfer studies and in vivo imaging. This study has shown that the CRISPR/Cas9-system can be used to modify the chicken genome in PGCs. Targeting efficiency for homologous recombination was increased by combinating with specific CRISPR/Cas9-constructs. Heterozygous mCherry+/- chickens and heterozygous C KO+/- chickens were successfully generated and will be used to address immunological questions in the chicken.