Fluoreszenzspektroskopie an einem neuartigen Wirkstoff der Diphenylpyrazol-Klasse zur Therapie neurodegenerativer Erkrankungen

Reiner, Anne (2017): Fluoreszenzspektroskopie an einem neuartigen Wirkstoff der Diphenylpyrazol-Klasse zur Therapie neurodegenerativer Erkrankungen. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik

Abstract

Die Fehlfaltung und Aggregation von Proteinen zu Amyloiden ist Teil der Pathogenese verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen. Diese Amyloide haben, anders als das jeweilige natürliche Protein, eine charakteristische β-Faltblattstruktur. Die Aggregate sind vermehrt im Gehirn der Patienten zu finden. Ihre Anreicherung und die damit verbundene Aggregation wird als Ursache für ihre Neurotoxizität vermutet. Ein therapeutisches Ziel ist demzufolge die Hemmung der Aggregation der Proteine. Zu diesem Zweck wurden tausende Moleküle in einem großen Screening auf ihre anti-aggregative Wirkung getestet [128]. Hier zeigte sich das Diphenylpyrazol (DPP) anle138b vielversprechend, das auch in Tierversuchen eine Wirkung erzielte. Die Verabreichung der Substanz anle138b führte dabei zu einer Modulation der Aggregation und gleichzeitig zu einer längeren Überlebenszeit erkrankter Mäuse (Prion infizierte Mäuse, transgene Parkinson- und Taumäuse). Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Fluoreszenz des biologisch relevan- ten Moleküls anle138b und einigen anderen DPP-Derivaten. Es wird dabei das Fluoreszenzverhalten im Detail untersucht und wichtige Informationen über die Interaktion der DPP-Moleküle mit den Aggregaten erhalten. Das charakteristische Fluoreszenzverhalten der Substanz anle138b erlaubt es, die Bindungsstöchiometrie mit α-Synuclein und hTau46 Fibrillen zu bestimmen. Dabei kann eine starke Bindung (Kd ∼ 200 nM) zu beiden Aggregaten festgestellt werden. Über eine direkte kompeti- tive Messung mit dem bekannten Marker der Proteinaggregation Thioflavin T ist es möglich die Bindungsstelle in der Fibrille genauer einzugrenzen. Mittels stationärer und zeitaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie wird die Fluoreszenz der DPP-Derivate in verschiedenen Lösungsmitteln und Proteinfibrillen aufgeklärt. In polaren proti- schen Lösungsmitteln kann eine duale Fluoreszenz beobachtet werden, wobei hier eine starke Beschleunigung des Zerfalls des angeregten Zustands auftritt. Das Auftreten der rotverschobenen Fluoreszenz deutet hierbei auf einen ladungsgetrennten Zustand hin. Dieser wird durch eine Protonierung oder Wasserstoffbrückenbindung am Pyrazol induziert und in polaren Lösungsmitteln stabilisiert. In unpolaren Lösungsmitteln oder Proteinfibrillen wird dieser Zustand nur schwach oder gar nicht besetzt. Die Fluoreszenz der DPP-Derivate in den Fibrillen gibt wichtige Informationen über die Bindungsstelle, die demnach unpolar und von der wässrigen Umgebung abgeschirmt ist. Eine erst kürzlich veröffentlichte Struktur der α-Synuclein Fibrille [121] schlägt mehrere mögliche Bindungsstellen für kleine aggregationsmodulierende Moleküle vor. Aus dem Vergleich mit den hier gewonnenen Ergebnissen der Fluoreszenzspektrosko- pie, kann eine potentielle Bindungsstelle für anle138b in dieser Struktur angegeben werden.

Abstract

The misfolding and aggregation of proteins into amyloids is part of the pathogenesis of several neurodegenerative diseases. In contrast to the native protein the amyloids have a β-sheet structure. The aggregates can be found in the patients brains and their accumulation and aggregation is thought to be associated with their neurotoxicity. One therapeutic approach could be the inhibition of the aggregation of those proteins. To this purpose thousands of molecules were screened for anti-aggregative properties [128]. Here, the diphenyl-pyrazole (DPP) anle138b could achieve promising results in vitro as well as in mouse models. The application of the substance lead to a modulation of the aggregation. Simultaneously, a prolongation of the survival time of diseased mice could be observed (prion infected mice, transgenic Parkinson mice and Tau-mice). In this thesis the fluorescence of the biologically relevant molecule anle138b and derivates is investigated. The fluorescence is investigated in detail and important informations about the interaction of the DPP molecules with the aggregates can be achieved. The characteristic fluorescence properties of anle138b can be used to determine the binding stoichiometry of anle138b to α-synuclein and hTau46 fibrillar structures. Here a strong binding (Kd ∼ 200 nM) could be observed. The binding site for anle138b in the fibril could be localized by a direct competition measurement with the popular marker of protein aggregation Thioflavin T. Using stationary and time-resolved fluorescence measurements the fluorescence properties of the compounds can be explained. In polar protic solvents a dual fluorescence is observed. Here a strong acceleration of the decay of the excited state occurs. The red-shifted fluorescence points to a charge-transfer state. This state is stabilized by polar solvents. In nonpolar solvents or protein fibrils the state is at most only weakly populated. The fluorescence of the DPP molecules in the fibrils gives important information on the binding site. From this it follows that the binding site should be nonpolar and shielded from the surrounding water molecules. In a recently published structure of an α-synuclein fibril [121] several binding sites for aggregation modulating molecules are suggested. By comparison with the results from the fluorescence investigations one possible binding site for anle138b in this structure can be indicated.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
• Fakultäten: Fakultät für Physik
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 8. August 2017
• 1. Bericht­erstatter:in: Zinth, Wolfgang