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Pathological Notch3 aggregation. role of cysteine-sparing mutations and antiaggregatory strategies in CADASIL
Pathological Notch3 aggregation. role of cysteine-sparing mutations and antiaggregatory strategies in CADASIL
Cerebral small vessel disease (SVD), characterized by pathological processes that affect structure and function of the brain microvasculature and result in subsequent damage of the cerebral white and deep grey matter, is the main cause for long-term disability and vascular dementia. Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy (CADASIL), the most common form of monogenic SVD leading to early-onset stroke and vascular dementia, is caused by mutations in the Notch3 transmembrane receptor. Accumulation and deposition of the extracellular domain of Notch3 (Notch3-ECD) in blood vessel walls are the earliest disease manifestations. However, the underlying molecular pathomechanism is incompletely understood and specific treatment options are not available. To study the aggregation behavior of Notch3 mutants we have recently developed an in vitro aggregation assay based on recombinant Notch3-ECD fragments and their detection by the single-molecule spectroscopy technique called scanning for intensely fluorescent targets (SIFT). While the vast majority of CADASIL mutations alter the number of cysteine residues within the Notch3-ECD, over the last years several mutations not involving a cysteine have been reported to be associated with a CADASIL-like phenotype provoking a debate about their clinical significance. In the first part of this work, the in vitro assay was applied to study the pathogenic potential of five of these mutations. Three of them showed an aggregation behavior similar to cysteine-affecting mutations, a finding supported by the typical CADASIL-like clinical appearance of the mutation carriers and we thus classified them as pathogenic mutations. For the two other mutants the available clinical data had been fragmentary and in agreement with that, no significant aggregation potential was observed, strongly suggesting that they represent apathogenic polymorphisms. Thus, our in vitro assay offers new insights into the Notch3 aggregation mechanism and may serve as diagnostic tool determining the clinical relevance of cysteine-sparing mutations. In the second part of this thesis, the in vitro assay was used to search for small-molecule aggregation inhibitors. Several synthetic compounds of the diphenylpyrazole (DPP) class as well as natural polyphenolic substances with antiaggregatory properties were identified. They not only inhibited the de novo aggregation of mutant Notch3 but were also capable of dissolving pre-formed aggregates. Some of the compounds were subsequently shown to be also effective in a novel cellular assay based on the accumulation of mutant Notch3 in the extracellular matrix (ECM) of mouse embryonic fibroblasts (MEF). With this study on drug-mediated inhibition of Notch3 accumulation we have laid a basis for an antiaggregation therapy., Zerebrale Mikroangiopathien sind die häufigste Ursache für Langzeitbehinderung und vaskuläre Demenz. Sie sind durch pathologische Prozesse charakterisiert, die die Struktur und Funktion der Mikrovaskulatur im Gehirn beeinträchtigen und dadurch zu Schädigungen der weißen und tiefen grauen Substanz führen. CADASIL (zerebrale autosomaldominante Arteriopathie mit subkortikalen Infarkten und Leukoenzephalopathie), die häufigste monogene Form zerebraler Mikroangiopathien, führt zu juvenilen Schlaganfällen und vaskulärer Demenz und wird durch Mutationen im Notch3 Rezeptor verursacht. Frühestes pathologisches Merkmal ist die Akkumulation und Ablagerung der extrazellulären Domäne von Notch3 (Notch3-ECD) in den Wänden kleiner Blutgefäße. Allerdings ist bisher wenig über den zu Grunde liegenden molekularen Pathomechanismus bekannt und spezielle Behandlungsmöglichkeiten sind nicht verfügbar. Um das Aggregationsverhalten von Notch3 Mutanten zu studieren, haben wir einen in vitro Aggregationsassay entwickelt, der auf rekombinanten Notch3-ECD Fragmenten und ihrer Detektion mittels SIFT (scanning for intensely fluorescent targets) beruht, einer speziellen Einzelmolekülspektroskopietechnik. Während die Mehrheit der CADASIL Mutationen die Anzahl der Cysteinreste in der Notch3-ECD verändert, ist in den letzten Jahren mehrfach über Mutationen ohne Cysteinbeteiligung berichtet worden, die mit einem CADASIL-ähnlichen Phänotyp assoziiert sind und über deren klinische Relevanz derzeit diskutiert wird. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der in vitro Assay zur Untersuchung des pathogenen Potentials von fünf dieser Mutationen verwendet. Drei von ihnen zeigten ein ähnliches Aggregationspotential wie klassische Cystein-Mutationen, ein Befund, der durch die typischen CADASIL Symptome der Mutationsträger gestützt wird. Wir klassifizieren sie daher als pathogene Mutationen. Für die beiden anderen Mutanten, deren klinische Beschreibung lückenhaft war, konnte dementsprechend kein signifikantes Aggregationspotential beobachtet werden, so dass sie wahrscheinlich apathogene Polymorphismen darstellen. Somit eröffnet unser in vitro Assay neue Einblicke in den Notch3-Aggregationsmechanismus und könnte als diagnostische Methode zur Bestimmung der klinischen Relevanz von Nicht-Cystein Mutationen eingesetzt werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der in vitro Assay für die Suche nach kleinen Molekülen mit aggregationsinhibierender Aktivität eingesetzt. Mehrere synthetische Substanzen aus der Klasse der Diphenylpyrazole (DPP), sowie natürliche Polyphenole mit antiaggregatorischen Eigenschaften wurden identifiziert. Sie hemmten nicht nur die de novo Aggregation von einer Notch3 Mutante, sie waren auch in der Lage, präformierte Aggregate wieder aufzulösen. Für einige der Substanzen konnte anschließend auch eine Wirkung in einem zellulären Assay gezeigt werden, der auf der Akkumulation einer Notch3 Mutante in der extrazellulären Matrix (ECM) muriner embryonaler Fibroblasten (MEF) beruht. Mit dieser Studie zur substanzvermittelten Hemmung der Notch3 Akkumulation haben wir den Grundstein für eine Antiaggregationstherapie gelegt.
Not available
Fresser, Patrizia
2016
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Fresser, Patrizia (2016): Pathological Notch3 aggregation: role of cysteine-sparing mutations and antiaggregatory strategies in CADASIL. Dissertation, LMU München: Faculty of Chemistry and Pharmacy
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Abstract

Cerebral small vessel disease (SVD), characterized by pathological processes that affect structure and function of the brain microvasculature and result in subsequent damage of the cerebral white and deep grey matter, is the main cause for long-term disability and vascular dementia. Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy (CADASIL), the most common form of monogenic SVD leading to early-onset stroke and vascular dementia, is caused by mutations in the Notch3 transmembrane receptor. Accumulation and deposition of the extracellular domain of Notch3 (Notch3-ECD) in blood vessel walls are the earliest disease manifestations. However, the underlying molecular pathomechanism is incompletely understood and specific treatment options are not available. To study the aggregation behavior of Notch3 mutants we have recently developed an in vitro aggregation assay based on recombinant Notch3-ECD fragments and their detection by the single-molecule spectroscopy technique called scanning for intensely fluorescent targets (SIFT). While the vast majority of CADASIL mutations alter the number of cysteine residues within the Notch3-ECD, over the last years several mutations not involving a cysteine have been reported to be associated with a CADASIL-like phenotype provoking a debate about their clinical significance. In the first part of this work, the in vitro assay was applied to study the pathogenic potential of five of these mutations. Three of them showed an aggregation behavior similar to cysteine-affecting mutations, a finding supported by the typical CADASIL-like clinical appearance of the mutation carriers and we thus classified them as pathogenic mutations. For the two other mutants the available clinical data had been fragmentary and in agreement with that, no significant aggregation potential was observed, strongly suggesting that they represent apathogenic polymorphisms. Thus, our in vitro assay offers new insights into the Notch3 aggregation mechanism and may serve as diagnostic tool determining the clinical relevance of cysteine-sparing mutations. In the second part of this thesis, the in vitro assay was used to search for small-molecule aggregation inhibitors. Several synthetic compounds of the diphenylpyrazole (DPP) class as well as natural polyphenolic substances with antiaggregatory properties were identified. They not only inhibited the de novo aggregation of mutant Notch3 but were also capable of dissolving pre-formed aggregates. Some of the compounds were subsequently shown to be also effective in a novel cellular assay based on the accumulation of mutant Notch3 in the extracellular matrix (ECM) of mouse embryonic fibroblasts (MEF). With this study on drug-mediated inhibition of Notch3 accumulation we have laid a basis for an antiaggregation therapy.

Abstract

Zerebrale Mikroangiopathien sind die häufigste Ursache für Langzeitbehinderung und vaskuläre Demenz. Sie sind durch pathologische Prozesse charakterisiert, die die Struktur und Funktion der Mikrovaskulatur im Gehirn beeinträchtigen und dadurch zu Schädigungen der weißen und tiefen grauen Substanz führen. CADASIL (zerebrale autosomaldominante Arteriopathie mit subkortikalen Infarkten und Leukoenzephalopathie), die häufigste monogene Form zerebraler Mikroangiopathien, führt zu juvenilen Schlaganfällen und vaskulärer Demenz und wird durch Mutationen im Notch3 Rezeptor verursacht. Frühestes pathologisches Merkmal ist die Akkumulation und Ablagerung der extrazellulären Domäne von Notch3 (Notch3-ECD) in den Wänden kleiner Blutgefäße. Allerdings ist bisher wenig über den zu Grunde liegenden molekularen Pathomechanismus bekannt und spezielle Behandlungsmöglichkeiten sind nicht verfügbar. Um das Aggregationsverhalten von Notch3 Mutanten zu studieren, haben wir einen in vitro Aggregationsassay entwickelt, der auf rekombinanten Notch3-ECD Fragmenten und ihrer Detektion mittels SIFT (scanning for intensely fluorescent targets) beruht, einer speziellen Einzelmolekülspektroskopietechnik. Während die Mehrheit der CADASIL Mutationen die Anzahl der Cysteinreste in der Notch3-ECD verändert, ist in den letzten Jahren mehrfach über Mutationen ohne Cysteinbeteiligung berichtet worden, die mit einem CADASIL-ähnlichen Phänotyp assoziiert sind und über deren klinische Relevanz derzeit diskutiert wird. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der in vitro Assay zur Untersuchung des pathogenen Potentials von fünf dieser Mutationen verwendet. Drei von ihnen zeigten ein ähnliches Aggregationspotential wie klassische Cystein-Mutationen, ein Befund, der durch die typischen CADASIL Symptome der Mutationsträger gestützt wird. Wir klassifizieren sie daher als pathogene Mutationen. Für die beiden anderen Mutanten, deren klinische Beschreibung lückenhaft war, konnte dementsprechend kein signifikantes Aggregationspotential beobachtet werden, so dass sie wahrscheinlich apathogene Polymorphismen darstellen. Somit eröffnet unser in vitro Assay neue Einblicke in den Notch3-Aggregationsmechanismus und könnte als diagnostische Methode zur Bestimmung der klinischen Relevanz von Nicht-Cystein Mutationen eingesetzt werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der in vitro Assay für die Suche nach kleinen Molekülen mit aggregationsinhibierender Aktivität eingesetzt. Mehrere synthetische Substanzen aus der Klasse der Diphenylpyrazole (DPP), sowie natürliche Polyphenole mit antiaggregatorischen Eigenschaften wurden identifiziert. Sie hemmten nicht nur die de novo Aggregation von einer Notch3 Mutante, sie waren auch in der Lage, präformierte Aggregate wieder aufzulösen. Für einige der Substanzen konnte anschließend auch eine Wirkung in einem zellulären Assay gezeigt werden, der auf der Akkumulation einer Notch3 Mutante in der extrazellulären Matrix (ECM) muriner embryonaler Fibroblasten (MEF) beruht. Mit dieser Studie zur substanzvermittelten Hemmung der Notch3 Akkumulation haben wir den Grundstein für eine Antiaggregationstherapie gelegt.