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Petersen, Alyssa (2016): Influence of blood storage time and temperature on the evaluation of blood smears from Hermann’s tortoises (Testudo hermanni). Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

In the presented study the influence of the storage time and storage temperature of blood samples on the interpretability and results in blood smears from Hermann’s tortoises (Testudo hermanni) was investigated, with emphasis on the differential blood count and the morphological changes in the blood cells during storage. To rule out influences from individual animals but gather a larger amount of results, the same animals were sampled repeatedly once a month. From each blood sample, containing lithium heparin as anticoagulans, smears were produced directly after the blood sampling and subsequently, aliquots were stored at room temperature or fridge temperature. After 1 h, 48 h and 96 h, smears were produced from each aliquot and stained with a Pappenheim stain. The smears were then evaluated according to a standardised protocol, including an assessment of predefined criteria for macroscopic and microscopic quality as well as the bacterial growth and the cytoplasmic vacuoles in the erythrocytes. A differential blood count was established as well. During the microscopic evaluations, a photographic documentation of the blood cells was performed, including the changes occuring after prolonged storage. While the macroscopic quality did not show a strong influence of storage time and temperature, the microscopic quality mostly declined with prolonged storage in both temperatures. The bacterial growth and the cytoplasmic vacuoles in erythrocytes both increased distinctly with prolonged storage at room temperature. For the fridge temperature, the increase was less distinct, but existent. The leucocyte percentage values showed a clear difference between the two storage temperatures. While the percentage distribution remained uninfluenced by fridge temperature, the specimens stored at room temperature yielded a decline of heterophils and an increase of lymphocytes with prolonged storage. When investigating the morphological changes, changes in cell size and colour were found as well as lysed cells and cytoplasmic vacuoles. In some smears produced from blood with prolonged storage it became difficult to distinguish between heterophils and eosinophils. The differentiation of thrombocytes and small lymphocytes was difficult to start with and this problem increased with prolonged storage. This investigation also revealed an influence of the month of blood sampling and the individual animals on the quality parameters of the smears. Furthermore, a photographic reference for the blood cells of T. hermanni is provided, showing the blood cells in their normal, unaffected appearance as well as an exemplary presentation of the morphological changes. In this investigation the existence of two types of thrombocytes was documented for the first time for T. hermanni. These photographs may serve as a reference for practitioners, to correctly identify the different cell types in T. hermanni and to avoid the mistaking of storage artefacts as pathological signs. From the results, it can be concluded that blood smears should be stored at fridge temperature for a maximum of 48 h before producing smears to obtain reliable results. Blood samples stored at fridge temperature for 96 h still yielded a reliable differential blood count, but were much more tedious to evaluate. Blood samples stored at room temperature for 48 h and more did not procure reliable results and should be discarded. If it is necessary to store blood samples for durations of 48 h or more, for example when shipping to external laboratories, appropriate measures are recommended, such as isolated packaging and additional cooling with ice packs or similar in hot climates. This study was aimed at providing recommendations for the handling of blood smears in veterinary practice to contribute towards the improved medical care of reptiles. In view of the current debate about the captive husbandry of reptiles in private ownership with a consequential possible initiation of positive or negative lists in Germany, this study represents fundamental research which is still necessary to ensure medical care for reptiles based on a scientifically well-grounded knowledge.

Abstract

Die vorliegende Studie untersuchte den Einfluss der Lagerungsdauer und der Lagerungstemperatur von Blutproben auf die Auswertbarkeit und die Ergebnisse von Blutausstrichen bei Griechischen Landschildkröten (Testudo hermanni). Dabei lag der Schwerpunkt auf dem Differentialblutbild und den morphologischen Veränderungen der Blutzellen. Um eine größere Probenanzahl zu erhalten, aber eine Beeinflussung der Ergebnisse durch individuelle Abweichungen innerhalb der Tiere möglichst auszuschließen, wurden dieselben Tiere mehrfach beprobt. Von jeder Blutprobe, mit Lithium-Heparin als Antikoagulans, wurden Ausstriche direkt nach der Blutentnahme angefertigt. Anschließend wurden die Blutproben zu gleichen Teilen jeweils bei Kühlschrank- und Raumtemperatur gelagert. Nach 1 h, 48 h und 96 h wurden von jeder Teilprobe Ausstriche angefertigt. Alle Ausstriche wurden mit einer Pappenheim-Färbung angefärbt und anschließend nach einem standardisierten Protokoll ausgewertet. Die Auswertung beinhaltete die Bewertung von makroskopischer und mikroskopischer Qualität anhand von vordefinierten Kriterien sowie die Bewertung des Bakterienwachstums und der zytoplasmatischen Vakuolen in den Erythrozyten. Ein Differentialblutbild wurde ebenfalls erstellt. Während die makroskopische Qualität durch die Lagerungsdauer und die Lagerungstemperatur nicht stark beeinflusst wurde, verschlechterte sich die mikroskopische Qualität mit zunehmender Lagerungsdauer bei beiden Temperaturen. Das Bakterienwachstum und die zytoplasmatischen Vakuolen in Erythrozyten zeigten mit zunehmender Lagerungsdauer bei Raumtemperatur einen deutlichen Anstieg. Bei Kühlschranktemperatur war dieser Anstieg ebenfalls vorhanden, jedoch weniger ausgeprägt. Die Leukozytenwerte wiesen einen deutlichen Unterschied zwischen den beiden Lagerungstemperaturen auf. Während die prozentuale Verteilung durch die Lagerung bei Kühlschranktemperatur unbeeinflusst blieb, zeigte sich bei Raumtemperatur mit zunehmender Lagerungsdauer ein Abfall der Heterophilen und ein Anstieg der Lymphozyten. Bei der Untersuchung der morphologischen Veränderungen wurden Veränderungen der Zellgröße und -farbe ebenso gefunden wie lysierte Zellen und zytoplasmatische Vakuolen. In einigen Ausstrichen von Blutproben mit verlängerter Lagerungsdauer wurde es schwierig, zwischen Heterophilen und Eosinophilen zu unterscheiden. Die Unterscheidung von Thrombozyten und kleinen Lymphozyten war von Anfang an schwierig, was sich mit zunehmender Lagerungszeit weiter verschlechterte. Weiterhin zeigte sich in dieser Untersuchung ein Einfluss des Monats der Blutabnahme und des Einzeltiers auf die Qualitätsparameter des Ausstriches. Während der mikroskopischen Auswertungen wurde eine fotografische Referenz der Blutzellen von T. hermanni erstellt. Diese zeigt das normale, unbeeinflusste Erscheinungsbild der Blutzellen, sowie eine beispielhafte Dokumentation der morphologischen Veränderungen durch verlängerte Lagerung. In dieser Studie wurden erstmalig zwei verschiedene Typen von Thrombozyten bei T. hermanni dokumentiert. Diese Fotografien können als Referenz für Praktiker dienen, um die verschiedenen Zelltypen bei T. hermanni korrekt zu identifizieren und außerdem eine Einstufung von Lagerungsartefakten als pathologische Anzeichen zu vermeiden. Anhand der Ergebnisse kann darauf geschlossen werden, dass, um verlässliche Ergebnisse zu erhalten, Blutproben bei Kühlschranktemperatur für maximal 48 h gelagert werden sollten. Die Blutproben lieferten nach Lagerung für 96 h bei Kühlschranktemperatur zwar nach wie vor verlässliche Ergebnisse, allerdings war die Auswertung zeitaufwendig und mühselig. Blutproben, die bei Raumtemperatur für 48 h und mehr gelagert wurden, ergaben keine verlässlichen Ergebnisse mehr und sollten verworfen werden. Falls eine Aufbewahrung von Blutproben für 48 h oder mehr notwendig ist, beispielsweise bei Versand zu externen Laboren, werden entsprechende Maßnahmen empfohlen, wie isolierende Verpackungen und zusätzliche Kühlung mittels Kühlakkus oder ä̈hnlichem bei warmem Wetter. Diese Studie zielte darauf ab, Empfehlungen für den Umgang mit Blutproben in der tierärztlichen Praxis zu erstellen um einen Beitrag zur verbesserten medizinischen Versorgung von Reptilien zu leisten. Angesichts der aktuellen Diskussion um Reptilienhaltung in Privathand mit einer möglichen Einführung von Positiv- oder Negativlisten in Deutschland ist Grundlagenforschung wie die vorliegende Studie von großer Relevanz, um eine auf wissenschaftlichen Kenntnissen basierende medizinische Versorgung von Reptilien sicherzustellen.