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Epigenetisch relevante DNA-Modifikationen. Identifikation von Interaktionspartnern mittels Crosslinker-basierten pull down Assays und quantitativer Massenspektrometrie
Epigenetisch relevante DNA-Modifikationen. Identifikation von Interaktionspartnern mittels Crosslinker-basierten pull down Assays und quantitativer Massenspektrometrie
Die aktive Demethylierung der DNA, die zu einer Reaktivierung stillgelegter Gene führen kann, beschäftigt Wissenschaftler nun schon seit über 30 Jahren. Als die Cytosin-Oxidationsprodukte 5-Hydroxymethylcytosin (hmC), 5-Formylcytosin (fC) und 5-Carboxylcytosin (caC) entdeckt wurden, glaubte man, damit Intermediate für diesen Prozess gefunden zu haben. Weitere Hypothesen sprechen den neu entdeckten Basen sogar darüber hinausgehende biologische Funktionen zu. Unterstützt werden diese Hypothesen durch wenige, bisher durchgeführte Studien über DNA-Protein-Wechselwirkungen und der Analyse möglicher, spezifischer Interaktoren. Die verwendeten Methoden stoßen aufgrund der komplexen Zusammenhänge immer wieder an ihre Grenzen und so ist man noch weit davon entfernt, die genauen Mechanismen und das Zusammenspiel mit anderen epigenetischen Schaltersystemen, wie beispielsweise dem Histon-Code, zu verstehen. Um dem Ziel der Aufklärung von Wechselwirkungen zwischen epigenetisch modifizierter DNA und bestimmten Proteinen näher zu kommen, wurde in dieser Arbeit eine Methode etabliert, mit deren Hilfe komplexe Proteinproben auf DNA-Interaktoren gescreent und gleichzeitig direkte von indirekten Bindern unterschieden werden können. Dies wurde durch die Einführung eines spaltbaren, Aminogruppen-spezifischen Crosslinker an den DNA-Sonden erreicht. Durch diesen werden Proteine zunächst kovalent an die DNA-Sonden gebunden und alle übrigen Proteine mit geringer Affinität zur DNA oder zu den gebundenen Proteinen können durch mehrere Waschschritte entfernt werden. Während eines Reduktionsschrittes wird der Crosslinker gespalten, so dass die Proteine einerseits von der DNA abgetrennt und andererseits durch einen kleinen verbleibenden Teil des Crosslinkers markiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass nach dem anschließenden Verdau die Peptide mit dem Crosslinker-Rest bei der nachfolgenden massenspektrometrischen Analyse identifizierbar sind und dem jeweiligen Protein zugeordnet werden können. Da die Struktur des Crosslinkers prinzipiell frei wählbar ist und über die Click-Reaktion an jede DNA angebracht werden kann, die ein Alkin als funktionelle Gruppe enthält, ist die Methode universell für jede DNA-Sequenz oder -Modifikation anwendbar. Durch den Einsatz isobarer Markierungsreagenzien wurde eine relative Quantifizierung der Proteine ermöglicht. Darüber hinaus wurden die biochemischen Methoden optimiert, so dass möglichst viele spezifische Proteine an der DNA angereichert und gleichzeitig unspezifisch signifikant angereicherte Proteine vermieden werden konnten. Der Amino-reaktive Crosslinker wurde in drei unabhängigen Studien eingesetzt. In allen drei Studien konnten mit den entsprechenden DNA-Sonden viele Proteine angereichert werden, die in Gene Ontology (GO)-Analysen ein konsistentes Bild ergeben. Eine Verfeinerung der Methode und der Software-basierten Auswertung konnte noch nicht abgeschlossen werden. Deshalb wurde mit dem in diesen Studien verwendeten DNA-Protein-Crosslinker eine Eingrenzung der angereicherten Proteine auf wenige, vielversprechende Kandidaten noch nicht erreicht. In der ersten Studie wurde versucht aufzuklären, welche Proteine in murinen Stammzellen (mESCs) mit 5-Hydroxymethyluracil (hmU) interagieren. Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass hmU in mESCs nicht durch Desaminierung von hmC als Teil eines möglichen aktiven Demethylierungsmechanismus entsteht, sondern vielmehr durch Oxidation von Thymin (T) durch Ten-eleven translocation Methylcytosin Dioxygenasen (Tet-Enzyme).[1] Für die anschließende Studie wurde hmU sowohl in Stellung gegenüber Adenosin (A) (entsteht bei der Oxidation von T) als auch gegenüber Guanosin (G) (entsteht bei der Desaminierung von hmC) untersucht. Auch hmC war Teil dieser Studie. Es stellte sich heraus, dass überwiegend Proteine angereichert werden konnten, die an der Genexpression und Chromosomenorganisation beteiligt sind. Da es im direkten Vergleich kaum Überschneidungen zwischen den gefundenen Proteinen in den drei Ansätzen gibt, kann davon ausgegangen werden, dass viele Proteine nicht nur eine DNA-Modifikation spezifisch erkennen können, sondern auch unterscheiden mit welcher Base die Modifikation gepaart ist und damit der Ursprung der Modifikation eine erhebliche Rolle spielt. Bei der Wiederholung des Experiments mit einer alternativen Basensequenz der DNA-Sonde konnte das Ergebnis auf Grund einer schlechten Zellkernlysat Präparation noch nicht eindeutig bestätigt werden. Die zweite Studie befasste sich mit mC-, hmC- und fC-interagierenden Proteinen während der Entwicklung der Retina von Mäusen vor und nach dem Zeitpunkt, an dem die Tiere die Augen öffnen. Innerhalb dieser Zeitspanne teilen sich die neuronalen Zellen der Retina nicht mehr und es konnte beobachtet werden, dass die mC-Level fast gleich bleiben, während die hmC-Level stark ansteigen und die fC-Level stark abfallen.[2] Außerdem ist bekannt, dass steigende hmC-Level in neuronalen Zellen mit einem Anstieg der Genexpression korrelieren. DNA-Sonden mit je einer der drei Cytosinderivate mC, hmC und fC und dem NHS-Ester-Crosslinker wurden für pull down Studien aus Zellkernextrakten muriner Retinagewebe zu den verschiedenen Entwicklungsstadien verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass die Mengen an angereicherten Proteinen an den DNA-Sonden mit den ermittelten endogenen Vorkommen der Cytosinderivate korrelieren. Unter den angereicherten hmC-Bindern wurden einige Proteine gefunden, die in einer anderen Studie über die Tet3-induzierte Genexpression als Tet3-Binder identifiziert wurden. Bei der dritten Studie wurde untersucht, ob es unterschiedliche fC-bindende Proteine bei der Entwicklung von murinen Stammzellen zu Epiblast-ähnlichen Zellen innerhalb von 48 h gibt. Der Zeitraum wurde aufgrund der von Jessica Steinbacher durchgeführten fC-Level-Messung gewählt, die einen deutlichen Anstieg der Modifikation zeigt. Die pull down Studien wurden zu den Zeitpunkten d0, d1 und d2 mit DNA-Sonden durchgeführt, die den NHS-Ester-Crosslinker und fC enthielten. Mit dem Anstieg des endogenen fC-Levels über den beobachteten Zeitraum wurde ein Sinken der Anzahl an fC-bindenden Proteinen festgestellt. Während zu den Zeitpunkten d0 und d1 überwiegend Proteine angereichert wurden, die an der Genexpression und Transkription beteiligt sind, wurden zum Zeitpunkt d2 Proteine angereichert, die an der Chromatinorganisation beteiligt sind. Besonders auffällig war, dass sehr viele verschiedene Histonprotein-Varianten angereichert wurden, die v.a. zu den ersten beiden Zeitpunkten auch mit dem Crosslinker markiert wurden. Dies könnte ein Hinweis auf eine sich verändernde Chromatinstruktur sein. Auf Grund dieser Ergebnisse wurde die Studie auf die Identifikation und relative Quantifizierung von Histonmodifikationen ausgeweitet. Dadurch konnte gezeigt werden, dass der Grad an Histonmodifikationen innerhalb der ersten 24 h sinkt und danach wieder ansteigt. Möglicherweise hängt dies mit einer epigenetischen Reprogrammierung der Zellen zusammen., For over 30 years scientists are engaged in studying the process of active demethylation of DNA, which enables the reactivation of silenced genes. When the cytosine oxidation states 5-hydroxymethylcytosine (hmC), 5-formylcytosine (fC) and 5-carboxylcytosine (caC) were discovered, they were considered as intermediates of this mechanism. Further hypotheses attribute even additional biological functions to the newly discovered bases. These hypotheses are supported by the few studies conducted till today covering DNA-protein interactions and the analysis of potential specific interactors. The applied methods reach their limit because of the complex correlations, affectively limiting the understanding of the exact mechanisms and of the interplay with other epigenetic control systems like e.g. the Histone code. With the objective to shed light on the interaction between epigenetically modified DNA and specific proteins, this dissertation establishes a method to screen complex protein samples for DNA interactors, while at the same time distinguishing direct from indirect binders. This was achieved by the introduction of a cleavable, amino-group-specific crosslinker at the DNA probes. This crosslinker connects proteins temporarily with the DNA probes. All other proteins with lower affinity to either the DNA probe or the bound proteins can be removed by several washing steps. During protein reduction, the crosslinker will be cleaved in a way that proteins are released from the DNA probes but will be labelled with a small remaining moiety of the crosslinker. It was demonstrated, that after protein digestion the peptides, labelled with the crosslinker residue, can be identified in a subsequent mass spectrometric analysis and assigned to the respective protein. This method can be applied universally for every DNA sequence or modification, because the structure of the crosslinker is arbitrary and can be attached to any alkyne-bearing DNA by click reaction. In addition, isobaric labeling enabled a relative quantification. Furthermore, biochemical methods were optimised in order to enrich as many specific proteins as possible with the DNA, while at the same time avoiding the enrichment of unspecifically binding proteins. The amino-reactive crosslinker was applied in three independent studies. In all of the three studies, a large number of proteins were enriched with the corresponding DNA probe, so that the subsequent gene ontology analysis showed consistent results. A refinement of the method and the software based analysis is pending to date. This is why it was not possible to confine the enriched proteins to provide promising candidates with the help of the DNA-protein-crosslinker used in these studies. The first study aimed at clarifying which proteins interact with 5-hydroxymethyluracil (hmU) in murine embryonic stem cells (mESCs). Our research group was able to demonstrate that hmU is not created by deamination of hmC as a part of a potentially active demethylation mechanism in mESCs, but indeed by the ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenases (Tet-enzymes) mediated oxidation of thymine (T).[1] In the subsequent study hmU was examined once paired with adenosine (A) (result of T oxidation) and once paired with guanosine (G) (result of hmC deamination). hmC was part of the study as well. It was discovered that primarily those proteins were enriched which are part of gene expression and chromosome organisation. In a direct comparison between the discovered proteins in the three approaches, barley any overlaps were found; this gives evidence that many proteins not only specifically recognize a DNA modification, but also distinguish between the base pairings. This suggests that the origin of the modification plays a significant role. The repetition of the experiment with an alternative base sequence of the DNA probe was not yet able to confirm the previous results, because of an insufficient preparation of the nuclear cell lysate. The second study focused on proteins interacting with mC, hmC and fC during the development of the retina in mice before and after the time of eye opening. Within this period the neuronal retina cells do not longer divide and it was observed that mC levels stay constant, while hmC levels strongly increase and fC levels strongly decrease.[2] It is also known that raising hmC levels correlate with an increased gene expression. DNA probes, each containing one of the three cytosine derivatives mC, hmC and fC, and the NHS-ester-crosslinker, were used for pull down studies from nuclear cell lysates of murine retinal tissue at the two different stages of development. The results show a correlation between the amounts of enriched proteins by the DNA probes and the measured levels of endogenous cytosine derivatives. Among the enriched hmC binders, some proteins were found which also have been identified as Tet3 binders in another study about Tet3-induced gene expression. The third study examined if there are different fC binding proteins during the development of mESCs towards epiblast like cells (EpiLCs) within 48 hours. This time period was chosen on the basis of fC level measurements (conducted by Jessica Steinbacher), which showed a significant increase of the modification. The pull down studies were performed at the time points d0, d1 and d2 with DNA probes containing the NHS ester crosslinker and fC modification. With the rise of endogenous fC levels during the monitored period, a decrease in the number of fC binding proteins could be observed. While at the times d0 and d1 predominantly proteins were enriched, which are involved in gene expression and transcription, at the time d2 proteins were enriched, which are involved in chromatin organisation. It was also particularly conspicuous that a number of different histone variants were enriched at all investigated times, and especially those proteins found at the first two time points were labelled with the crosslinker. This could be an indication for a changing chromatin structure during development. Due to these results, the study was extended to the identification and relative quantification of histone modifications. Here it was shown, that the global levels of histone modifications drop within the first 24 hours of mESC development and then rise again within the next 24 hours. Perhaps these findings indicate a connection to epigenetic reprogramming of the cells.
DNA-Modifikationen, Epigenetik, Massenspektrometrie
Laube, Silvia Katharina
2017
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Laube, Silvia Katharina (2017): Epigenetisch relevante DNA-Modifikationen: Identifikation von Interaktionspartnern mittels Crosslinker-basierten pull down Assays und quantitativer Massenspektrometrie. Dissertation, LMU München: Faculty of Chemistry and Pharmacy
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Abstract

Die aktive Demethylierung der DNA, die zu einer Reaktivierung stillgelegter Gene führen kann, beschäftigt Wissenschaftler nun schon seit über 30 Jahren. Als die Cytosin-Oxidationsprodukte 5-Hydroxymethylcytosin (hmC), 5-Formylcytosin (fC) und 5-Carboxylcytosin (caC) entdeckt wurden, glaubte man, damit Intermediate für diesen Prozess gefunden zu haben. Weitere Hypothesen sprechen den neu entdeckten Basen sogar darüber hinausgehende biologische Funktionen zu. Unterstützt werden diese Hypothesen durch wenige, bisher durchgeführte Studien über DNA-Protein-Wechselwirkungen und der Analyse möglicher, spezifischer Interaktoren. Die verwendeten Methoden stoßen aufgrund der komplexen Zusammenhänge immer wieder an ihre Grenzen und so ist man noch weit davon entfernt, die genauen Mechanismen und das Zusammenspiel mit anderen epigenetischen Schaltersystemen, wie beispielsweise dem Histon-Code, zu verstehen. Um dem Ziel der Aufklärung von Wechselwirkungen zwischen epigenetisch modifizierter DNA und bestimmten Proteinen näher zu kommen, wurde in dieser Arbeit eine Methode etabliert, mit deren Hilfe komplexe Proteinproben auf DNA-Interaktoren gescreent und gleichzeitig direkte von indirekten Bindern unterschieden werden können. Dies wurde durch die Einführung eines spaltbaren, Aminogruppen-spezifischen Crosslinker an den DNA-Sonden erreicht. Durch diesen werden Proteine zunächst kovalent an die DNA-Sonden gebunden und alle übrigen Proteine mit geringer Affinität zur DNA oder zu den gebundenen Proteinen können durch mehrere Waschschritte entfernt werden. Während eines Reduktionsschrittes wird der Crosslinker gespalten, so dass die Proteine einerseits von der DNA abgetrennt und andererseits durch einen kleinen verbleibenden Teil des Crosslinkers markiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass nach dem anschließenden Verdau die Peptide mit dem Crosslinker-Rest bei der nachfolgenden massenspektrometrischen Analyse identifizierbar sind und dem jeweiligen Protein zugeordnet werden können. Da die Struktur des Crosslinkers prinzipiell frei wählbar ist und über die Click-Reaktion an jede DNA angebracht werden kann, die ein Alkin als funktionelle Gruppe enthält, ist die Methode universell für jede DNA-Sequenz oder -Modifikation anwendbar. Durch den Einsatz isobarer Markierungsreagenzien wurde eine relative Quantifizierung der Proteine ermöglicht. Darüber hinaus wurden die biochemischen Methoden optimiert, so dass möglichst viele spezifische Proteine an der DNA angereichert und gleichzeitig unspezifisch signifikant angereicherte Proteine vermieden werden konnten. Der Amino-reaktive Crosslinker wurde in drei unabhängigen Studien eingesetzt. In allen drei Studien konnten mit den entsprechenden DNA-Sonden viele Proteine angereichert werden, die in Gene Ontology (GO)-Analysen ein konsistentes Bild ergeben. Eine Verfeinerung der Methode und der Software-basierten Auswertung konnte noch nicht abgeschlossen werden. Deshalb wurde mit dem in diesen Studien verwendeten DNA-Protein-Crosslinker eine Eingrenzung der angereicherten Proteine auf wenige, vielversprechende Kandidaten noch nicht erreicht. In der ersten Studie wurde versucht aufzuklären, welche Proteine in murinen Stammzellen (mESCs) mit 5-Hydroxymethyluracil (hmU) interagieren. Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass hmU in mESCs nicht durch Desaminierung von hmC als Teil eines möglichen aktiven Demethylierungsmechanismus entsteht, sondern vielmehr durch Oxidation von Thymin (T) durch Ten-eleven translocation Methylcytosin Dioxygenasen (Tet-Enzyme).[1] Für die anschließende Studie wurde hmU sowohl in Stellung gegenüber Adenosin (A) (entsteht bei der Oxidation von T) als auch gegenüber Guanosin (G) (entsteht bei der Desaminierung von hmC) untersucht. Auch hmC war Teil dieser Studie. Es stellte sich heraus, dass überwiegend Proteine angereichert werden konnten, die an der Genexpression und Chromosomenorganisation beteiligt sind. Da es im direkten Vergleich kaum Überschneidungen zwischen den gefundenen Proteinen in den drei Ansätzen gibt, kann davon ausgegangen werden, dass viele Proteine nicht nur eine DNA-Modifikation spezifisch erkennen können, sondern auch unterscheiden mit welcher Base die Modifikation gepaart ist und damit der Ursprung der Modifikation eine erhebliche Rolle spielt. Bei der Wiederholung des Experiments mit einer alternativen Basensequenz der DNA-Sonde konnte das Ergebnis auf Grund einer schlechten Zellkernlysat Präparation noch nicht eindeutig bestätigt werden. Die zweite Studie befasste sich mit mC-, hmC- und fC-interagierenden Proteinen während der Entwicklung der Retina von Mäusen vor und nach dem Zeitpunkt, an dem die Tiere die Augen öffnen. Innerhalb dieser Zeitspanne teilen sich die neuronalen Zellen der Retina nicht mehr und es konnte beobachtet werden, dass die mC-Level fast gleich bleiben, während die hmC-Level stark ansteigen und die fC-Level stark abfallen.[2] Außerdem ist bekannt, dass steigende hmC-Level in neuronalen Zellen mit einem Anstieg der Genexpression korrelieren. DNA-Sonden mit je einer der drei Cytosinderivate mC, hmC und fC und dem NHS-Ester-Crosslinker wurden für pull down Studien aus Zellkernextrakten muriner Retinagewebe zu den verschiedenen Entwicklungsstadien verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass die Mengen an angereicherten Proteinen an den DNA-Sonden mit den ermittelten endogenen Vorkommen der Cytosinderivate korrelieren. Unter den angereicherten hmC-Bindern wurden einige Proteine gefunden, die in einer anderen Studie über die Tet3-induzierte Genexpression als Tet3-Binder identifiziert wurden. Bei der dritten Studie wurde untersucht, ob es unterschiedliche fC-bindende Proteine bei der Entwicklung von murinen Stammzellen zu Epiblast-ähnlichen Zellen innerhalb von 48 h gibt. Der Zeitraum wurde aufgrund der von Jessica Steinbacher durchgeführten fC-Level-Messung gewählt, die einen deutlichen Anstieg der Modifikation zeigt. Die pull down Studien wurden zu den Zeitpunkten d0, d1 und d2 mit DNA-Sonden durchgeführt, die den NHS-Ester-Crosslinker und fC enthielten. Mit dem Anstieg des endogenen fC-Levels über den beobachteten Zeitraum wurde ein Sinken der Anzahl an fC-bindenden Proteinen festgestellt. Während zu den Zeitpunkten d0 und d1 überwiegend Proteine angereichert wurden, die an der Genexpression und Transkription beteiligt sind, wurden zum Zeitpunkt d2 Proteine angereichert, die an der Chromatinorganisation beteiligt sind. Besonders auffällig war, dass sehr viele verschiedene Histonprotein-Varianten angereichert wurden, die v.a. zu den ersten beiden Zeitpunkten auch mit dem Crosslinker markiert wurden. Dies könnte ein Hinweis auf eine sich verändernde Chromatinstruktur sein. Auf Grund dieser Ergebnisse wurde die Studie auf die Identifikation und relative Quantifizierung von Histonmodifikationen ausgeweitet. Dadurch konnte gezeigt werden, dass der Grad an Histonmodifikationen innerhalb der ersten 24 h sinkt und danach wieder ansteigt. Möglicherweise hängt dies mit einer epigenetischen Reprogrammierung der Zellen zusammen.

Abstract

For over 30 years scientists are engaged in studying the process of active demethylation of DNA, which enables the reactivation of silenced genes. When the cytosine oxidation states 5-hydroxymethylcytosine (hmC), 5-formylcytosine (fC) and 5-carboxylcytosine (caC) were discovered, they were considered as intermediates of this mechanism. Further hypotheses attribute even additional biological functions to the newly discovered bases. These hypotheses are supported by the few studies conducted till today covering DNA-protein interactions and the analysis of potential specific interactors. The applied methods reach their limit because of the complex correlations, affectively limiting the understanding of the exact mechanisms and of the interplay with other epigenetic control systems like e.g. the Histone code. With the objective to shed light on the interaction between epigenetically modified DNA and specific proteins, this dissertation establishes a method to screen complex protein samples for DNA interactors, while at the same time distinguishing direct from indirect binders. This was achieved by the introduction of a cleavable, amino-group-specific crosslinker at the DNA probes. This crosslinker connects proteins temporarily with the DNA probes. All other proteins with lower affinity to either the DNA probe or the bound proteins can be removed by several washing steps. During protein reduction, the crosslinker will be cleaved in a way that proteins are released from the DNA probes but will be labelled with a small remaining moiety of the crosslinker. It was demonstrated, that after protein digestion the peptides, labelled with the crosslinker residue, can be identified in a subsequent mass spectrometric analysis and assigned to the respective protein. This method can be applied universally for every DNA sequence or modification, because the structure of the crosslinker is arbitrary and can be attached to any alkyne-bearing DNA by click reaction. In addition, isobaric labeling enabled a relative quantification. Furthermore, biochemical methods were optimised in order to enrich as many specific proteins as possible with the DNA, while at the same time avoiding the enrichment of unspecifically binding proteins. The amino-reactive crosslinker was applied in three independent studies. In all of the three studies, a large number of proteins were enriched with the corresponding DNA probe, so that the subsequent gene ontology analysis showed consistent results. A refinement of the method and the software based analysis is pending to date. This is why it was not possible to confine the enriched proteins to provide promising candidates with the help of the DNA-protein-crosslinker used in these studies. The first study aimed at clarifying which proteins interact with 5-hydroxymethyluracil (hmU) in murine embryonic stem cells (mESCs). Our research group was able to demonstrate that hmU is not created by deamination of hmC as a part of a potentially active demethylation mechanism in mESCs, but indeed by the ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenases (Tet-enzymes) mediated oxidation of thymine (T).[1] In the subsequent study hmU was examined once paired with adenosine (A) (result of T oxidation) and once paired with guanosine (G) (result of hmC deamination). hmC was part of the study as well. It was discovered that primarily those proteins were enriched which are part of gene expression and chromosome organisation. In a direct comparison between the discovered proteins in the three approaches, barley any overlaps were found; this gives evidence that many proteins not only specifically recognize a DNA modification, but also distinguish between the base pairings. This suggests that the origin of the modification plays a significant role. The repetition of the experiment with an alternative base sequence of the DNA probe was not yet able to confirm the previous results, because of an insufficient preparation of the nuclear cell lysate. The second study focused on proteins interacting with mC, hmC and fC during the development of the retina in mice before and after the time of eye opening. Within this period the neuronal retina cells do not longer divide and it was observed that mC levels stay constant, while hmC levels strongly increase and fC levels strongly decrease.[2] It is also known that raising hmC levels correlate with an increased gene expression. DNA probes, each containing one of the three cytosine derivatives mC, hmC and fC, and the NHS-ester-crosslinker, were used for pull down studies from nuclear cell lysates of murine retinal tissue at the two different stages of development. The results show a correlation between the amounts of enriched proteins by the DNA probes and the measured levels of endogenous cytosine derivatives. Among the enriched hmC binders, some proteins were found which also have been identified as Tet3 binders in another study about Tet3-induced gene expression. The third study examined if there are different fC binding proteins during the development of mESCs towards epiblast like cells (EpiLCs) within 48 hours. This time period was chosen on the basis of fC level measurements (conducted by Jessica Steinbacher), which showed a significant increase of the modification. The pull down studies were performed at the time points d0, d1 and d2 with DNA probes containing the NHS ester crosslinker and fC modification. With the rise of endogenous fC levels during the monitored period, a decrease in the number of fC binding proteins could be observed. While at the times d0 and d1 predominantly proteins were enriched, which are involved in gene expression and transcription, at the time d2 proteins were enriched, which are involved in chromatin organisation. It was also particularly conspicuous that a number of different histone variants were enriched at all investigated times, and especially those proteins found at the first two time points were labelled with the crosslinker. This could be an indication for a changing chromatin structure during development. Due to these results, the study was extended to the identification and relative quantification of histone modifications. Here it was shown, that the global levels of histone modifications drop within the first 24 hours of mESC development and then rise again within the next 24 hours. Perhaps these findings indicate a connection to epigenetic reprogramming of the cells.