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Identifizierung und Charakterisierung von Kazachstania psychrophila-Isolaten aus vakuumverpackten Fleischproben
Identifizierung und Charakterisierung von Kazachstania psychrophila-Isolaten aus vakuumverpackten Fleischproben
Psychrophile Hefen sind ubiquitär vorkommende Pilze, die sich an extreme Lebensbedingungen angepasst haben. Inzwischen konnten sie auch aus unterschiedlichen Lebensmitteln isoliert werden. Hinsichtlich ihrer Eigenschaften und ihrer Bedeutung als Verderbserreger existieren nur wenige Kenntnisse. In vorliegender Arbeit wurden insgesamt 20 psychrophile Hefe-Isolate mykologisch untersucht. Alle Isolate haben ihren Ursprung in vakuumverpackten Fleischproben, bei denen es sich teilweise um verdorbene Rindfleischproben aus Deutschland (n=3), sowie um vakuumverpacktes Frischfleisch aus Australien (n=3), Argentinien (n=2) und Deutschland (n=2) handelte. Von den 20 psychrophilen Isolaten stammten 7 Isolate aus den frischen vakuumverpackten Fleischproben und 13 Isolate aus verdorbenem vakuumverpacktem Fleisch. Die Isolate wurden phänotypisch, biochemisch, genotypisch und massenspektrometrisch untersucht. Die Genotypisierung erlaubte eine Zuordnung aller untersuchten Hefe-Isolate zu Kazachstania (K.) psychrophila. Bei der morphologischen Beurteilung ergab sich eine Lappung der Kolonieränder auf Sabouraud-Agar für zwei Isolate (Isolate 4 und 17), was auf das Vorhandensein von Subspezies für K. psychrophila schließen lassen könnte. Die biochemische Untersuchung bestätigte diesen Eindruck, da die Hefe-Isolate in insgesamt 7 Gruppen (A-G) unterteilt werden konnten. Eine Korrelation der Gruppeneinteilung mit den morphologischen Unterschieden und der Herkunft der Isolate konnte jedoch nicht beobachtet werden. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war es, unter Berücksichtigung des Einflusses der Anzuchtbedingungen, massenspektrometrische Referenzdaten auf Basis der MALDI-TOF-MS für die psychrophilen Hefen K. psychrophila, M. frigida und M. gelida, sowie für die mesophilen Spezies K. lodderae, K. servazzii und K. unispora zu erstellen. Dabei wurde für K. psychrophila ein Einfluss der Kultivierung auf Columbia-Schafblutagar auf das massenspektrometrische Erscheinungsbild nachgewiesen, was sich jedoch nicht negativ auf die Identifizierbarkeit auswirkte. Neben der eindeutigen Identifizierung aller 20 Isolate als K. psychrophila mittels MALDI-TOF- MS wurde zusätzlich eine verkürzte Extraktionsmethode (YOTL) mit Erfolg getestet. Neben der Sequenzanalyse erwies sich damit die MALDI-TOF-MS als eine verlässliche Alternative zur Identifikation psychrophiler Hefen aus Lebensmitteln., Due to their ability to grow at low temperatures and their low requirement for essential nutrition, psychrophilic yeasts have successfully colonized permanent cold environments. In the past they were also found in different types of food, particularly in chilled vacuum-packed beef. There is little information about how they enter food and their true capability to cause spoilage in food. Therefore, 20 psychrophilic yeast isolates from fresh (n=7) and spoiled (n=3) vacuum-packed meat samples had been examined mycologically. The meat samples had their origin in Germany (n=5), Australia (n=3) and Argentina (n=2). The spoiled meat samples (n=3) originated from Germany. By sequencing the 26S rDNA gene of the large subunit, all strains (n=20) were identified as K. psychrophila, whereby morphological and biochemical divergences had been observed. An example for morphological divergences is the forming of irregularly formed margins on Sabouraud´s agar by two of the isolates (isolate 4 and 17). This highlights the possibility of the existence of subtypes belonging to the psychrophilic yeast K. psychrophila. This impression was confirmed by the devision of the yeast isolates in 7 different biochemical groups (A-G). A correlation between isolates from fresh vacuum-packed meat and spoiled meat in view of the morphologic and biochemical divergences could not have been observed. A main focus of this work was the reliable identification of psychrohilic food-borne yeasts by the MALDI-TOF technique, involving the influence of the culture conditions on yeast spectra. While in clinical laboratories the MALDI-TOF-MS has been successfully introduced for rapid species identification of human pathogenic microorganisms, there is no reliable and rapid way of identifying a large amount of food-borne yeasts. Therefore, sequencing the 26S rDNA gene of the large subunit is still the gold standard in identifying food-borne yeasts, which is both time-consuming and involves huge costs. In present study could have been shown, that apart from genomical analysis the identification of psychrophilic yeasts by MALDI-TOF-MS affords a reliable alternative.
psychrophil, Hefen, Kazachstania, MALDI-TOF-MS, Identifizierung
Vetter, Stephanie
2017
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Vetter, Stephanie (2017): Identifizierung und Charakterisierung von Kazachstania psychrophila-Isolaten aus vakuumverpackten Fleischproben. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Psychrophile Hefen sind ubiquitär vorkommende Pilze, die sich an extreme Lebensbedingungen angepasst haben. Inzwischen konnten sie auch aus unterschiedlichen Lebensmitteln isoliert werden. Hinsichtlich ihrer Eigenschaften und ihrer Bedeutung als Verderbserreger existieren nur wenige Kenntnisse. In vorliegender Arbeit wurden insgesamt 20 psychrophile Hefe-Isolate mykologisch untersucht. Alle Isolate haben ihren Ursprung in vakuumverpackten Fleischproben, bei denen es sich teilweise um verdorbene Rindfleischproben aus Deutschland (n=3), sowie um vakuumverpacktes Frischfleisch aus Australien (n=3), Argentinien (n=2) und Deutschland (n=2) handelte. Von den 20 psychrophilen Isolaten stammten 7 Isolate aus den frischen vakuumverpackten Fleischproben und 13 Isolate aus verdorbenem vakuumverpacktem Fleisch. Die Isolate wurden phänotypisch, biochemisch, genotypisch und massenspektrometrisch untersucht. Die Genotypisierung erlaubte eine Zuordnung aller untersuchten Hefe-Isolate zu Kazachstania (K.) psychrophila. Bei der morphologischen Beurteilung ergab sich eine Lappung der Kolonieränder auf Sabouraud-Agar für zwei Isolate (Isolate 4 und 17), was auf das Vorhandensein von Subspezies für K. psychrophila schließen lassen könnte. Die biochemische Untersuchung bestätigte diesen Eindruck, da die Hefe-Isolate in insgesamt 7 Gruppen (A-G) unterteilt werden konnten. Eine Korrelation der Gruppeneinteilung mit den morphologischen Unterschieden und der Herkunft der Isolate konnte jedoch nicht beobachtet werden. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war es, unter Berücksichtigung des Einflusses der Anzuchtbedingungen, massenspektrometrische Referenzdaten auf Basis der MALDI-TOF-MS für die psychrophilen Hefen K. psychrophila, M. frigida und M. gelida, sowie für die mesophilen Spezies K. lodderae, K. servazzii und K. unispora zu erstellen. Dabei wurde für K. psychrophila ein Einfluss der Kultivierung auf Columbia-Schafblutagar auf das massenspektrometrische Erscheinungsbild nachgewiesen, was sich jedoch nicht negativ auf die Identifizierbarkeit auswirkte. Neben der eindeutigen Identifizierung aller 20 Isolate als K. psychrophila mittels MALDI-TOF- MS wurde zusätzlich eine verkürzte Extraktionsmethode (YOTL) mit Erfolg getestet. Neben der Sequenzanalyse erwies sich damit die MALDI-TOF-MS als eine verlässliche Alternative zur Identifikation psychrophiler Hefen aus Lebensmitteln.

Abstract

Due to their ability to grow at low temperatures and their low requirement for essential nutrition, psychrophilic yeasts have successfully colonized permanent cold environments. In the past they were also found in different types of food, particularly in chilled vacuum-packed beef. There is little information about how they enter food and their true capability to cause spoilage in food. Therefore, 20 psychrophilic yeast isolates from fresh (n=7) and spoiled (n=3) vacuum-packed meat samples had been examined mycologically. The meat samples had their origin in Germany (n=5), Australia (n=3) and Argentina (n=2). The spoiled meat samples (n=3) originated from Germany. By sequencing the 26S rDNA gene of the large subunit, all strains (n=20) were identified as K. psychrophila, whereby morphological and biochemical divergences had been observed. An example for morphological divergences is the forming of irregularly formed margins on Sabouraud´s agar by two of the isolates (isolate 4 and 17). This highlights the possibility of the existence of subtypes belonging to the psychrophilic yeast K. psychrophila. This impression was confirmed by the devision of the yeast isolates in 7 different biochemical groups (A-G). A correlation between isolates from fresh vacuum-packed meat and spoiled meat in view of the morphologic and biochemical divergences could not have been observed. A main focus of this work was the reliable identification of psychrohilic food-borne yeasts by the MALDI-TOF technique, involving the influence of the culture conditions on yeast spectra. While in clinical laboratories the MALDI-TOF-MS has been successfully introduced for rapid species identification of human pathogenic microorganisms, there is no reliable and rapid way of identifying a large amount of food-borne yeasts. Therefore, sequencing the 26S rDNA gene of the large subunit is still the gold standard in identifying food-borne yeasts, which is both time-consuming and involves huge costs. In present study could have been shown, that apart from genomical analysis the identification of psychrophilic yeasts by MALDI-TOF-MS affords a reliable alternative.