Probing single molecules and binding networks

Greiss, Ferdinand (2017): Probing single molecules and binding networks: detection of single molecules on the multi-cellular scale with reflected light-sheet microscopy and probing the cooperativity of binding networks with high-throughput thermophoresis. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik

Abstract

Biologische Prozesse haben sich im Lauf der Zeit aus den Interaktionen einzelnerMoleküle zur Orchestrierung ganzer Organismen entwickelt. Biophysikalische Messplattformen fördern das Wissen über jeden dieser Schritte und werden dabei helfen die unterschiedlichen Aspekte zu vereinen. In dieser Arbeit wurden zwei quantitative Methoden für die Biophysik entwickelt. Beide repräsentieren Instanzen, die an den verschiedenen Enden des Spektrums sitzen: Die Untersuchung einzelner Moleküle und die Charakterisierung von Bindungsnetzwerken. In der Literatur wurde reflektierende Lichtscheibenmikroskopie verwendet, um die vorteilhaften Eigenschaften der freien 3D-Abbildung und die Empfindlichkeit zum Detektieren einzelner Moleküle zu kombinieren. Die Technik verwendet einen Spiegel, der das Lichtblatt auf die Brennebene des Erfassungsobjektivs reflektiert. In dieser Arbeit wurde ein fixiertes Mikroprisma eingeführt, das die Verwendung von Objektiven mit hoher numerischer Apertur erlaubt und die optische Ausrichtung vereinfacht. Gemeinsam wurden einzelne 10 kDa Dextran-Alexa647 Moleküle tief im Drosophila Embryo im Spätstadium etwa 80 µm über dem Deckglas aufgenommen. Die Detektion und Verfolgung auf der multizellulären Ebene zeigte unterschiedliche Verhaltensweisen, die stark mit dem jeweiligen Ort korrelierten. Während im Perivitellin-Raum Brownsche Bewegung nachgewiesen werden konnte, wurde ein aktiver Transport in einzelnen Zellen der Epidermis beobachtet. Durch komplementäre Beobachtungen mit Rab5-GFP wurde der aktive Transport von Vesikeln dem endosomalen Transport zugeschrieben. Der Nachweis von Einzelmolekülen auf der multizelluläre Ebene bei verschiedenen Probentiefen ermöglicht und fördert die Untersuchung ihrer Rolle wie der Bindung von DNA als Transkriptionsfaktoren. Die Bildung supramolekularer Komplexe findet sich in vielen biologischen Systemen und ist die Grundlage für kooperatives Verhalten. Zu diesemZweck wurde eine Strategie als zweites Projekt entwickelt, um die Affinität von Molekülen in komplexen Bindungsnetzwerken zu untersuchen. Unter Verwendung des Prinzips der Thermophorese wurde eine Hochdurchsatz-Plattform entworfen, um Affinitäten in kleinen Volumina von 500 nL und standardisierten 1536 Microplatten zu messen. Die Plattform ermöglichte die thermodynamische Aufklärung eines heterotrimeren DNA-Komplexes, der die Struktur und topologische Eigenschaft biologischer Systeme widerspiegelt. Jeder intermediäre Bindungszustand wurde gleichzeitig mit einem einzigen Fluoreszenzfarbstoff untersucht. Durch systematische Basenpaar-Variationen wurde eine gekoppelte Bindung zwischen scheinbar unabhängigen Bindungsstellen gefunden, die aus der Struktur des Drei-Wege-Übergangs hervorgeht. Zusammen zeigen die beiden Projekte komplementäre biophysikalische Methoden und geben Einblicke in die Einzelmolekül-Diffusivität auf multizellulärer Ebene und der Bildung von Komplexen auf molekularer Ebene.

Abstract

Biological processes have evolved from the simple interaction of two molecules to the orchestration of entire organisms. Biophysical measurement platforms advance the knowledge about each of these fields and help to eventually combine all the pieces. In this work, the different aspects of biology were tackled with two newly developed quantitative methods for biophysics. Both represent instances sitting at the different ends of the spectrum: the investigation of single molecules and the characterization of binding networks. In literature, reflective light-sheet microscopy was employed to combine the beneficial attributes of free 3D imaging and the sensitivity to detect single molecules. The technique employs a mirror that reflects the light sheet onto the focal plane of the detection objective in order to selectively excite the sample. In this work, a fixed micro prism with reflective surface allowed to employ high numerical aperture objectives while keeping the optical alignment procedure at a minimum. Together, single 10 kDa Dextran-Alexa647 molecules were recorded deep in the late-stage Drosophila embryo roughly 80 µm above the cover slip surface. The detection and tracking on the multi-cellular scale revealed different behaviors that strongly correlated with the respective location. While Brownian motion was detected in the perivitelline space, active transportation was observed in individual cells of the epidermis. With complementary experiments using Rab5-GFP, the active transportation of vesicles was attributed to endosomal trafficking. The detection of single molecules on the multi-cellular scale at different sample depths enables and fosters to study their role such as transcription factor binding to DNA. The formation of supramolecular complexes is found in many biological systems and is the basis for cooperative behavior. To this end, a strategy was developed as second project to probe the affinity of molecules in complex binding networks. Using the principle of thermophoresis, a high-throughput platform was designed to measure affinities in small volumes of 500 nL and standard 1,536 well plates. The platform enabled to elucidate the thermodynamic properties of a heterotrimeric DNA complex that portrays the structure and topological property of biological systems. Each intermediate binding state was probed simultaneously with one single fluorescent dye. Through systematic base pair variations, a coupled binding between seemingly independent binding sites was found to arise from the structure of the three-way junction. In conclusion, the thermodynamic characterization of arbitrary binding networks improves the basic understanding of relevant processes such as self-assembly and complex formation. Together, the two projects present complementary biophysical methods and give insight into the single molecule diffusivity on the multi-cellular level and the formation of supramolecular complexes on the molecular one.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
• Fakultäten: Fakultät für Physik
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 9. März 2017
• 1. Bericht­erstatter:in: Braun, Dieter