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DNA-based artificial systems for mimicking membrane-related mechanisms and targeted delivery
DNA-based artificial systems for mimicking membrane-related mechanisms and targeted delivery
Im Laufe der letzten zehn Jahre hat sich DNA durch die Selbstorganisation komplementärer Sequenz als sehr vielseitiges Baumaterial auf der Nanometer Skala bewährt. Die Struktur der DNA erlaubt die Konstruktion von beliebig geformten, nanometergroßen Objekten und die Modifizierung mit einer Vielzahl an (Bio-)Molekülen mit Nanometer Genauigkeit, definierter Orientierung und kontrollierbarer Stöchiometrie. In dieser Dissertation wurden DNA-basierte Nanostrukturen für die Nachahmung membranbedingter biologischer Ereignisse und zielgerichteter Transportapplikationen vorgestellt. Im ersten Teil der Arbeit wurden das Potenzial zur gezielten Verabreichung und die Stabilität der entworfenen DNA-Nanostrukturen in zellulärer Umgebung untersucht. Zu diesem Zweck wurden DNA-Nanoröhren durch ein einzelsträngiges DNA-Kachel-Anordnungs hergestellt und mit Folat-Molekülen und siRNA funktionalisiert um spezifisch Gene in Krebszellen, die den Folatrezeptor überexprimieren abzuschalten. In dieser Studie beobachteten wir, dass DNA-Nanoröhrchen zum Endosom geleitet wurden, aber nicht zum Cytosol der Krebszellen. Übereinstimmend mit dieser Beobachtung, konnte kein Abschalten der Zielgene detektiert werden. Darüber hinaus stießen wir auf einige Herausforderungen hinsichtlich der Stabilität der Strukturen, die bei der Anwendung in vivo berücksichtigt werden müssen. Im zweiten Teil wurde die hierarchische Anordnung von membrangebundenen DNA- Origami-Strukturen untersucht. Dazu wurden dreischichtige DNA-Origami-Blockstrukturen über Cholesterin-Moleküle an die Lipiddoppelschichten gebunden, die frei auf den Membranen diffundierten. Eindimensionale Polymere und zweidimensionale Gitter wurden durch programmierten Selbstorganisation der Strukturen auf den Membranen unter Verwendung verschiedener Sätze von Verbindungsoligonukleotiden gebildet. Weiterhin wurden DNA-Origami-Triskelione zu sechseckigen Gittern zusammengebaut, die der Bildung von Clathrin- Vesikeln während der Endozytose glichen. Darüber hinaus führt die Gitterbildung zu einer Verformung der Lipidmembranen, die auf das Potential des Systems für eine kontrollierbare Formgebung der Membranen aufzeigt. Die Studie zeigte, dass selbstorganisierte DNA-Origami-Strukturen die hierarchische Assemblierung von Multiproteinkomplexen auf zytoplasmatischen Membranen nachahmen könnte. Im letzten Teil wurde die Verwendung von DNA-Nanoröhrchen untersucht, eine Immunreaktion in vivo zu induzieren oder zu unterdrücken. In der ersten Studie wurden DNA-Nanoröhren mit unmethylierten Cytosin-Phosphat-Guanin-Oligodesoxynukleotiden (CpG-ODNs) funktionalisiert und in den Skelettmuskel anästhesierter Mäuse injiziert, um eine Immunstimulation gezielt herbeizuführen. Wir beobachteten, dass DNA-Nanoröhren durch gewebsständige Makrophagen internalisiert wurden und in den Endosomen akkumulierten. Nur Mikroinjektion von CpG-funktionalisierten DNA-Nanoröhren, aber nicht undekorierte Nanoröhren oder CpG-ODNs induzierte eine signifikante Rekrutierung von Leukozyten zur Injektionsstelle sowie eine Aktivierung des NF-κB-Signalweges. In der zweiten Studie wurden DNA-Nanoröhren mit dem anti-inflammatorischem Wirkstoff Dexamethason über i-Motivsequenz funktionalisiert. Wir haben gezeigt, dass die Strukturen die Leukozyten-Rekrutierung in das entzündete Gewebe aufgrund der i-Motiv-abhängigen Freisetzung von Dexamethason hemmen.!, Over the last decade, DNA has proven to be an extremely versatile building material through the self-assembly of complementary oligonucleotides. The structure of DNA allows the construction of arbitrarily shaped objects in nanoscale which can be modified with a variety of (bio)molecules with nanometer precision, defined orientation and fully controlled stoichiometry. In this dissertation, DNA-based nanostructures were demonstrated for mimicking membrane-related biological events and targeted delivery applications. In the first part of the thesis, targeted delivery and the stability of the designed DNA nanostructures in the cellular environment were investigated. For this purpose, DNA nanotubes were produced via the single-stranded tile assembly method and functionalized with folate molecules and siRNA to specifically silence genes in folate receptor over- expressing cancer cells. In this study, we observed that DNA nanotubes reached to the endosome but not to the cytosol of the cancer cells.! Consistent with this observation, no silencing of the targeted gene could be detected. Furthermore, we encountered several challenges concerning the stability of the structures that have to be taken into account during in vivo delivery applications. In the second part, the hierarchical assembly of membrane-bound DNA origami structures was investigated. For this, three-layer DNA origami block structures were attached to the lipid bilayers via cholesterol molecules and diffused freely on the membranes. One-dimensional polymers and two-dimensional lattices were formed upon the programmed self-assembly of the structures on the membranes using different sets of connector oligonucleotides. DNA origami triskelions further assembled into hexagonal lattices that resembled the formation of clathrin-coated pits during endocytosis. Moreover, the lattice formation leads to deformation of the lipid membranes that indicates the potential of the system towards controllable sculpting of the membranes. The study demonstrated that self-assembled DNA origami structures could mimic the hierarchical assembly of multi-protein complexes on cytoplasmic membranes. In the last part, we investigated the use of DNA nanotubes to induce or suppress the immune reactions in vivo. In the first study, DNA nanotubes were functionalized with unmethylated cytosine-phsophate-guanine oligodeoxynucleotides (CpG ODNs) and microinjected into the skeletal muscle of anesthetized mice to induce immune stimulation. We observed that DNA nanotubes were internalized by tissue-resident macrophages and accumulated in their endosomes. Only microinjection of CpG functionalized DNA nanotubes but not of plain nanotubes or unfolded CpG ODNs induced the significant recruitment of leukocytes to the injection site as well as the activation of the NF-κB pathway. In the second study, DNA nanotubes were functionalized with the anti-inflammatory drug dexamethasone via an i-motif sequence. We demonstrated that these structures inhibited the leukocyte recruitment into the inflammed tissue due to the i-motif dependent release of dexamethasone.!
Not available
Kocabey, Samet
2016
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Kocabey, Samet (2016): DNA-based artificial systems for mimicking membrane-related mechanisms and targeted delivery. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
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Abstract

Im Laufe der letzten zehn Jahre hat sich DNA durch die Selbstorganisation komplementärer Sequenz als sehr vielseitiges Baumaterial auf der Nanometer Skala bewährt. Die Struktur der DNA erlaubt die Konstruktion von beliebig geformten, nanometergroßen Objekten und die Modifizierung mit einer Vielzahl an (Bio-)Molekülen mit Nanometer Genauigkeit, definierter Orientierung und kontrollierbarer Stöchiometrie. In dieser Dissertation wurden DNA-basierte Nanostrukturen für die Nachahmung membranbedingter biologischer Ereignisse und zielgerichteter Transportapplikationen vorgestellt. Im ersten Teil der Arbeit wurden das Potenzial zur gezielten Verabreichung und die Stabilität der entworfenen DNA-Nanostrukturen in zellulärer Umgebung untersucht. Zu diesem Zweck wurden DNA-Nanoröhren durch ein einzelsträngiges DNA-Kachel-Anordnungs hergestellt und mit Folat-Molekülen und siRNA funktionalisiert um spezifisch Gene in Krebszellen, die den Folatrezeptor überexprimieren abzuschalten. In dieser Studie beobachteten wir, dass DNA-Nanoröhrchen zum Endosom geleitet wurden, aber nicht zum Cytosol der Krebszellen. Übereinstimmend mit dieser Beobachtung, konnte kein Abschalten der Zielgene detektiert werden. Darüber hinaus stießen wir auf einige Herausforderungen hinsichtlich der Stabilität der Strukturen, die bei der Anwendung in vivo berücksichtigt werden müssen. Im zweiten Teil wurde die hierarchische Anordnung von membrangebundenen DNA- Origami-Strukturen untersucht. Dazu wurden dreischichtige DNA-Origami-Blockstrukturen über Cholesterin-Moleküle an die Lipiddoppelschichten gebunden, die frei auf den Membranen diffundierten. Eindimensionale Polymere und zweidimensionale Gitter wurden durch programmierten Selbstorganisation der Strukturen auf den Membranen unter Verwendung verschiedener Sätze von Verbindungsoligonukleotiden gebildet. Weiterhin wurden DNA-Origami-Triskelione zu sechseckigen Gittern zusammengebaut, die der Bildung von Clathrin- Vesikeln während der Endozytose glichen. Darüber hinaus führt die Gitterbildung zu einer Verformung der Lipidmembranen, die auf das Potential des Systems für eine kontrollierbare Formgebung der Membranen aufzeigt. Die Studie zeigte, dass selbstorganisierte DNA-Origami-Strukturen die hierarchische Assemblierung von Multiproteinkomplexen auf zytoplasmatischen Membranen nachahmen könnte. Im letzten Teil wurde die Verwendung von DNA-Nanoröhrchen untersucht, eine Immunreaktion in vivo zu induzieren oder zu unterdrücken. In der ersten Studie wurden DNA-Nanoröhren mit unmethylierten Cytosin-Phosphat-Guanin-Oligodesoxynukleotiden (CpG-ODNs) funktionalisiert und in den Skelettmuskel anästhesierter Mäuse injiziert, um eine Immunstimulation gezielt herbeizuführen. Wir beobachteten, dass DNA-Nanoröhren durch gewebsständige Makrophagen internalisiert wurden und in den Endosomen akkumulierten. Nur Mikroinjektion von CpG-funktionalisierten DNA-Nanoröhren, aber nicht undekorierte Nanoröhren oder CpG-ODNs induzierte eine signifikante Rekrutierung von Leukozyten zur Injektionsstelle sowie eine Aktivierung des NF-κB-Signalweges. In der zweiten Studie wurden DNA-Nanoröhren mit dem anti-inflammatorischem Wirkstoff Dexamethason über i-Motivsequenz funktionalisiert. Wir haben gezeigt, dass die Strukturen die Leukozyten-Rekrutierung in das entzündete Gewebe aufgrund der i-Motiv-abhängigen Freisetzung von Dexamethason hemmen.!

Abstract

Over the last decade, DNA has proven to be an extremely versatile building material through the self-assembly of complementary oligonucleotides. The structure of DNA allows the construction of arbitrarily shaped objects in nanoscale which can be modified with a variety of (bio)molecules with nanometer precision, defined orientation and fully controlled stoichiometry. In this dissertation, DNA-based nanostructures were demonstrated for mimicking membrane-related biological events and targeted delivery applications. In the first part of the thesis, targeted delivery and the stability of the designed DNA nanostructures in the cellular environment were investigated. For this purpose, DNA nanotubes were produced via the single-stranded tile assembly method and functionalized with folate molecules and siRNA to specifically silence genes in folate receptor over- expressing cancer cells. In this study, we observed that DNA nanotubes reached to the endosome but not to the cytosol of the cancer cells.! Consistent with this observation, no silencing of the targeted gene could be detected. Furthermore, we encountered several challenges concerning the stability of the structures that have to be taken into account during in vivo delivery applications. In the second part, the hierarchical assembly of membrane-bound DNA origami structures was investigated. For this, three-layer DNA origami block structures were attached to the lipid bilayers via cholesterol molecules and diffused freely on the membranes. One-dimensional polymers and two-dimensional lattices were formed upon the programmed self-assembly of the structures on the membranes using different sets of connector oligonucleotides. DNA origami triskelions further assembled into hexagonal lattices that resembled the formation of clathrin-coated pits during endocytosis. Moreover, the lattice formation leads to deformation of the lipid membranes that indicates the potential of the system towards controllable sculpting of the membranes. The study demonstrated that self-assembled DNA origami structures could mimic the hierarchical assembly of multi-protein complexes on cytoplasmic membranes. In the last part, we investigated the use of DNA nanotubes to induce or suppress the immune reactions in vivo. In the first study, DNA nanotubes were functionalized with unmethylated cytosine-phsophate-guanine oligodeoxynucleotides (CpG ODNs) and microinjected into the skeletal muscle of anesthetized mice to induce immune stimulation. We observed that DNA nanotubes were internalized by tissue-resident macrophages and accumulated in their endosomes. Only microinjection of CpG functionalized DNA nanotubes but not of plain nanotubes or unfolded CpG ODNs induced the significant recruitment of leukocytes to the injection site as well as the activation of the NF-κB pathway. In the second study, DNA nanotubes were functionalized with the anti-inflammatory drug dexamethasone via an i-motif sequence. We demonstrated that these structures inhibited the leukocyte recruitment into the inflammed tissue due to the i-motif dependent release of dexamethasone.!