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The role of impaired cGMP homeostasis in cone photoreceptor degeneration
The role of impaired cGMP homeostasis in cone photoreceptor degeneration
Achromatopsia (ACHM) is a currently untreatable inherited eye disease that severely impairs daylight vision. The clinical manifestation results from cone photoreceptor dysfunction and is characterized by poor visual acuity, lack of colour discrimination and photophobia. In addition, a progressive degeneration and loss of macular cone photoreceptors is observed. In total six disease genes are known, but the majority of patients carries mutations in CNGA3 (29% of cases) or CNGB3 (48% of cases); the two genes encoding the cone cyclic nucleotide-gated (CNG) channel. This ion channel is directly gated by the second messenger cyclic GMP (cGMP) and is an integral part of the so called phototransduction cascade that translates light signals into electrical stimuli. Interestingly, genetic deletion of the CNG channel subunit CNGA3 in mice leads to high cellular levels of cGMP in affected cone photoreceptors. The aim of this thesis was to characterize the role of impaired cGMP signalling during cone photoreceptor degeneration in the Cnga3 knockout (KO) mouse model for ACHM. First, the developmental time course of cGMP accumulation was investigated using a cGMP-specific antibody. One point worthy of note is that elevated cGMP levels could be observed as early as four days after birth. Using a virus-mediated in vivo gene knockdown (KD) approach it was possible to identify guanylate cyclase 2E (Gucy2e) as the main source of cGMP. Moreover, Gucy2e KD resulted in prolonged survival of cones in Cnga3 KO mice suggesting a toxic role of sustained cGMP overload in affected photoreceptors. Given the absence of CNG channels in Cnga3 KO cones this toxic effect has to be mediated by other cGMP targets. Promising candidates that were further investigated were the cGMP-dependent kinases (cGKs). To investigate the impact of elevated cGK signalling for photoreceptor viability a constitutively active cGK was overexpressed in wildtype mouse photoreceptors using viral vectors. This induced a dramatic decrease of the photoreceptor layer and demonstrated that these kinases can induce cell death. To verify this and to define the effect of the two kinase types, Cnga3 KO mice were cross-bread with cGKI and cGKII KO mice and further examined morphologically. Global loss of cGKII but not cGKI significantly protected cone photoreceptors resulting in lower levels of degeneration and cell death. This finding was confirmed using viral vector-mediated delivery of a cGKII specific shRNA into cone photoreceptors of Cnga3 KO mice. Expression of cGKII-shRNA in adult Cnga3 KO mice again showed a decrease of degeneration suggesting cGKII as a novel target for neuroprotection in cone degeneration. Finally, to further unravel the cGMP signalling triggering cell death in cones two proteomic approaches were performed to identify potential downstream targets of cGKII. These screens could identify a link between a cGMP-cGK-signalling pathway and the serine/threonine kinase Atr. In conclusion this thesis presents strong evidence that cGMP-signalling accelerates retinal degeneration and identifies cGMP/cGKII signalling as a novel target for neuroprotective therapies to prolong cone survival in ACHM and other cone degenerations., Achromatopsie (ACHM) ist eine bis heute nicht heilbare erblich bedingte Augenkrankheit, die das Sehvermögen bei Tageslicht erheblich beeinträchtigt. Die Symptome entstehen durch eine Dysfunktion der Zapfen und sind geprägt von einem vollständigen Ausfall des Farbsinns, einer geringen Sehschärfe und einer extremen Blendungsempfindlichkeit der Betroffenen. Außerdem ist eine schnell fortschreitende Degeneration der Zapfen in der Makula zu beobachten. Mutationen in sechs Genen werden mit ACHM assoziiert, die meisten Patienten tragen jedoch eine Mutation in den Genen, die den in den Zapfen exprimierten zyklisch-Nukleotid gesteuerten (CNG) Kanal kodieren: CNGA3 (29 % der Fälle) und CNGB3 (48 % der Fälle). Dieser Ionenkanal wird durch Bindung des zellulären Botenstoffes - dem zyklischen GMP (cGMP) - geöffnet und ist zudem ein wichtiger Bestandteil der „Sehkaskade“ (sog. Phototransduktionskaskade), die Lichtsignale in elektrische Impulse umwandelt. Interessanterweise führt eine genetische Deletion der Untereinheit CNGA3 bei Mäusen zu einem erhöhten zellulären Level von cGMP in betroffenen Zapfen. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der beeinträchtigten cGMP-Signalwege während der Zapfendegeneration des Cnga3 Knockout (KO) Mausmodelles zu charakterisieren. Zunächst wurde der entwicklungsspezifische Verlauf der cGMP Akkumulation untersucht. Überraschenderweise war bereits vier Tage nach der Geburt ein erhöhtes cGMP Level festzustellen. Mit Hilfe eines Virus-vermittelten Gen-Knockdowns (KD) war es möglich die Guanylatzyklase 2E (Gucy2E) als die Hauptquelle des cGMP in Zapfen zu identifizieren. Therapierte Augen zeigten eine erhöhte Zapfendichte, was darauf hinweist, dass eine cGMP-Überlastung toxische Auswirkungen auf die betroffenen Zapfen hat. Ohne den CNG-Kanal in Cnga3 KO Zapfen kann die toxische Wirkung nur durch andere cGMP-Targets herbeigeführt werden. Vielversprechend für weitere Experimente erschienen dabei die cGMP-abhängigen Kinasen (cGKs), die weiter untersucht wurden. Um die Auswirkungen von erhöhten cGK-Signalwegen zu untersuchen, wurde in Wildtypmäusen durch virale Vektoren eine konstitutiv aktive cGK überexprimiert. Dies hatte einen drastischen Verlust der Photorezeptorschicht zur Folge und zeigte, dass diese Kinasen Zelltod auslösen können. Um dies zu verifizieren wurden Cnga3 KO Mäuse mit cGKI und cGKII KO Mäusen gekreuzt und morphologisch untersucht. Ein globaler Verlust der cGKII nicht aber der cGKI schützte die Zapfen vor Zelltod und führte zu einer signifikant verminderten Degeneration. Dieses Ergebnis wurde durch die Applikation einer cGKII-shRNA in Cnga3 KO Mäusen bestätigt, die ebenfalls einen signifikanten Rückgang des Zellsterbens zeigte. Diese Anwendung zeigt, dass cGKII ein möglicher neuer Anknüpfungspunkt für neuroprotektive Mechanismen in Zapfendegenerationen sein kann. Um letztendlich den cGMP Signalweg, der zum Zelltod führt, besser verstehen zu können, wurden mögliche Targets der cGKII durch zwei Massenspektrometrie-Ansätze identifiziert. Die Ergebnisse dieser Experimente weisen auf einen Zusammenhang zwischen dem cGMP-cGK-Signalweg und der Serin/threonine Kinase Atr hin. Zusammenfassend liefert diese Arbeit aussagekräftige Nachweise, dass cGMP-Signalwege die retinale Degeneration beschleunigen und identifiziert einen cGMP-cGK Signalweg als neuen Anknüpfungspunkt für neuroprotektive Therapien um die Lebensdauer der Zapfen in ACHM und anderen Zapfendegenerationen zu verlängern.
Achromatopsia, autosomal recessive retinal disorder, cyclic nucleotide-gated (CNG) channel, CNGA3, retinal degeneration, cGMP, cGMP dependent kinase, cGMP signalling
Koch, Mirja Annika
2016
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Koch, Mirja Annika (2016): The role of impaired cGMP homeostasis in cone photoreceptor degeneration. Dissertation, LMU München: Faculty of Chemistry and Pharmacy
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Abstract

Achromatopsia (ACHM) is a currently untreatable inherited eye disease that severely impairs daylight vision. The clinical manifestation results from cone photoreceptor dysfunction and is characterized by poor visual acuity, lack of colour discrimination and photophobia. In addition, a progressive degeneration and loss of macular cone photoreceptors is observed. In total six disease genes are known, but the majority of patients carries mutations in CNGA3 (29% of cases) or CNGB3 (48% of cases); the two genes encoding the cone cyclic nucleotide-gated (CNG) channel. This ion channel is directly gated by the second messenger cyclic GMP (cGMP) and is an integral part of the so called phototransduction cascade that translates light signals into electrical stimuli. Interestingly, genetic deletion of the CNG channel subunit CNGA3 in mice leads to high cellular levels of cGMP in affected cone photoreceptors. The aim of this thesis was to characterize the role of impaired cGMP signalling during cone photoreceptor degeneration in the Cnga3 knockout (KO) mouse model for ACHM. First, the developmental time course of cGMP accumulation was investigated using a cGMP-specific antibody. One point worthy of note is that elevated cGMP levels could be observed as early as four days after birth. Using a virus-mediated in vivo gene knockdown (KD) approach it was possible to identify guanylate cyclase 2E (Gucy2e) as the main source of cGMP. Moreover, Gucy2e KD resulted in prolonged survival of cones in Cnga3 KO mice suggesting a toxic role of sustained cGMP overload in affected photoreceptors. Given the absence of CNG channels in Cnga3 KO cones this toxic effect has to be mediated by other cGMP targets. Promising candidates that were further investigated were the cGMP-dependent kinases (cGKs). To investigate the impact of elevated cGK signalling for photoreceptor viability a constitutively active cGK was overexpressed in wildtype mouse photoreceptors using viral vectors. This induced a dramatic decrease of the photoreceptor layer and demonstrated that these kinases can induce cell death. To verify this and to define the effect of the two kinase types, Cnga3 KO mice were cross-bread with cGKI and cGKII KO mice and further examined morphologically. Global loss of cGKII but not cGKI significantly protected cone photoreceptors resulting in lower levels of degeneration and cell death. This finding was confirmed using viral vector-mediated delivery of a cGKII specific shRNA into cone photoreceptors of Cnga3 KO mice. Expression of cGKII-shRNA in adult Cnga3 KO mice again showed a decrease of degeneration suggesting cGKII as a novel target for neuroprotection in cone degeneration. Finally, to further unravel the cGMP signalling triggering cell death in cones two proteomic approaches were performed to identify potential downstream targets of cGKII. These screens could identify a link between a cGMP-cGK-signalling pathway and the serine/threonine kinase Atr. In conclusion this thesis presents strong evidence that cGMP-signalling accelerates retinal degeneration and identifies cGMP/cGKII signalling as a novel target for neuroprotective therapies to prolong cone survival in ACHM and other cone degenerations.

Abstract

Achromatopsie (ACHM) ist eine bis heute nicht heilbare erblich bedingte Augenkrankheit, die das Sehvermögen bei Tageslicht erheblich beeinträchtigt. Die Symptome entstehen durch eine Dysfunktion der Zapfen und sind geprägt von einem vollständigen Ausfall des Farbsinns, einer geringen Sehschärfe und einer extremen Blendungsempfindlichkeit der Betroffenen. Außerdem ist eine schnell fortschreitende Degeneration der Zapfen in der Makula zu beobachten. Mutationen in sechs Genen werden mit ACHM assoziiert, die meisten Patienten tragen jedoch eine Mutation in den Genen, die den in den Zapfen exprimierten zyklisch-Nukleotid gesteuerten (CNG) Kanal kodieren: CNGA3 (29 % der Fälle) und CNGB3 (48 % der Fälle). Dieser Ionenkanal wird durch Bindung des zellulären Botenstoffes - dem zyklischen GMP (cGMP) - geöffnet und ist zudem ein wichtiger Bestandteil der „Sehkaskade“ (sog. Phototransduktionskaskade), die Lichtsignale in elektrische Impulse umwandelt. Interessanterweise führt eine genetische Deletion der Untereinheit CNGA3 bei Mäusen zu einem erhöhten zellulären Level von cGMP in betroffenen Zapfen. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der beeinträchtigten cGMP-Signalwege während der Zapfendegeneration des Cnga3 Knockout (KO) Mausmodelles zu charakterisieren. Zunächst wurde der entwicklungsspezifische Verlauf der cGMP Akkumulation untersucht. Überraschenderweise war bereits vier Tage nach der Geburt ein erhöhtes cGMP Level festzustellen. Mit Hilfe eines Virus-vermittelten Gen-Knockdowns (KD) war es möglich die Guanylatzyklase 2E (Gucy2E) als die Hauptquelle des cGMP in Zapfen zu identifizieren. Therapierte Augen zeigten eine erhöhte Zapfendichte, was darauf hinweist, dass eine cGMP-Überlastung toxische Auswirkungen auf die betroffenen Zapfen hat. Ohne den CNG-Kanal in Cnga3 KO Zapfen kann die toxische Wirkung nur durch andere cGMP-Targets herbeigeführt werden. Vielversprechend für weitere Experimente erschienen dabei die cGMP-abhängigen Kinasen (cGKs), die weiter untersucht wurden. Um die Auswirkungen von erhöhten cGK-Signalwegen zu untersuchen, wurde in Wildtypmäusen durch virale Vektoren eine konstitutiv aktive cGK überexprimiert. Dies hatte einen drastischen Verlust der Photorezeptorschicht zur Folge und zeigte, dass diese Kinasen Zelltod auslösen können. Um dies zu verifizieren wurden Cnga3 KO Mäuse mit cGKI und cGKII KO Mäusen gekreuzt und morphologisch untersucht. Ein globaler Verlust der cGKII nicht aber der cGKI schützte die Zapfen vor Zelltod und führte zu einer signifikant verminderten Degeneration. Dieses Ergebnis wurde durch die Applikation einer cGKII-shRNA in Cnga3 KO Mäusen bestätigt, die ebenfalls einen signifikanten Rückgang des Zellsterbens zeigte. Diese Anwendung zeigt, dass cGKII ein möglicher neuer Anknüpfungspunkt für neuroprotektive Mechanismen in Zapfendegenerationen sein kann. Um letztendlich den cGMP Signalweg, der zum Zelltod führt, besser verstehen zu können, wurden mögliche Targets der cGKII durch zwei Massenspektrometrie-Ansätze identifiziert. Die Ergebnisse dieser Experimente weisen auf einen Zusammenhang zwischen dem cGMP-cGK-Signalweg und der Serin/threonine Kinase Atr hin. Zusammenfassend liefert diese Arbeit aussagekräftige Nachweise, dass cGMP-Signalwege die retinale Degeneration beschleunigen und identifiziert einen cGMP-cGK Signalweg als neuen Anknüpfungspunkt für neuroprotektive Therapien um die Lebensdauer der Zapfen in ACHM und anderen Zapfendegenerationen zu verlängern.