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Development of molecular tools to study Daphnia - parasite dynamics
Development of molecular tools to study Daphnia - parasite dynamics
Evolutionary dynamics of hosts and their parasites are complex processes. In order to study these processes on genotype level, reliable molecular tools have to be developed. The goal of this thesis was to develop such tools for freshwater crustaceans - Daphnia longispina species complex and its parasites. On one hand, from the host side - an interspecific hybridization plays an important role. For tracing community dynamics and reticulate evolution in such a hybrid species complex, long-term comparative studies of natural populations are necessary. In order to conduct such a study, it is essential to access historical samples. These samples are usually suffering from low DNA quality due to the preservation chemical such as formaldehyde or denaturated ethanol, therefore traditional genotyping through length-based markers (such as microsatellites or allozymes) proved to be insufficient. For circumventing these issues, SNP- based markers were developed. Based on transcriptome data of one species belonging to the complex, it was possible to amplify and sequence several unlinked loci, which were then scanned for species-specific SNPs. Altogether 11 loci distinguishing all three species of the complex and their hybrids were developed and incorporated into PCR-RFLP assay. By comparing the taxon assignment from microsatellite and SNP data, there was found nearly perfect concordance. Finally, the genotyping method was successfully tested on samples dating back to the year 1960. On the other hand, parasite genetic studies are much more limited, in terms of availability of molecular markers. Only handful of parasites allows their cultivation under laboratory conditions inside the hosts. Even then, their disproportional amount of DNA compared to hosts and additional presence of other organisms present in media is forcing to rely on the traditional markers such as internal transcribed spacer (ITS). The traditional method of obtaining sequences to access the diversity (Sanger sequencing preceded by cloning – due to high intragenomic variation of this region) is becoming inefficient due to its high costs in terms of funds and time. Therefore, there was developed a molecular pipeline able to produce and process larger amount of sequence data with more accurate processing, specifically using a next-generation-sequencing platform (454). Afterwards a new bioinformatic pipeline QRS (quantification of representative sequences) was developed, inferring the representative sequences from the next generation sequencing (NGS) data sets (based on neighbor joining or statistical parsimony) and calculating their frequencies. Verification of the method was done by comparing the dataset with the previous study of population structure of Daphnia parasite Caullerya mesnili based on cloning and Sanger sequencing. Pipelines were then used for accessing genetic diversity of the two parasite microsporidian species (Berwaldia and MIC1) commonly infecting Daphnia longispina complex in Central Europe. Specifically, the patterns of geographic population structure, intraspecific genetic variation, and the recombination events were examined, which are necessary for better characterization of the biology of these parasites. The limited geographical variation that was observed in Berwaldia and the different lake origin of recombinant and parental sequences supports usage of a mobile secondary host hypothesis during the life cycle of this species. Similarly MIC1 seems to have a secondary host, however the secondary hosts of both parasites likely differ and the Berwaldia`s one is assumed to have a higher mobility than the one transmitting MIC1., Die evolutionäre Dynamik von Wirtsarten und ihren Parasiten beinhaltet komplexe Prozesse. Zur Untersuchung dieser Prozesse auf der Ebene des Genotyps ist die Entwicklung zuverlässiger molekularer Werkzeuge notwendig. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung solcher Werkzeuge für den Daphnia longispina-Artenkomplex (Süßwasser-Crustaceen) und seine Parasiten. Einerseits spielt auf Seiten des Wirts interspezifische Hybridisierung eine große Rolle. Um die Dynamik der Artengemeinschaft sowie die verästelte Evolution innerhalb eines solchen Hybridartenkomplexes nachzuvollziehen, sind vergleichende Langzeitstudien natürlicher Populationen notwendig. Zur Durchführung einer solchen Studie ist die Einbeziehung historischer Proben essentiell. Diese Proben haben üblicherweise den Nachteil einer niedrigen DNA-Qualität durch Konservierungsmittel wie Formaldehyd oder vergällter Ethanol. Daher erwiesen sich traditionelle Methoden zur Genotypisierung mittels längenbasierter Marker wie Mikrosatelliten oder Allozyme als unzureichend. Aus diesem Grund wurden SNP-basierte Marker entwickelt. Basierend auf Transkriptomdaten einer Art aus dem Daphnia longispina-Artenkomplex konnten mehrere ungekoppelte Loci amplifiziert, sequenziert und nach artspezifischen SNPs durchsucht werden. Insgesamt wurden 11 SNP-Marker entwickelt, die alle drei Arten und ihre Hybriden unterscheiden und mit Hilfe eines PCR-RFLP-Tests untersucht wurden. Beim Vergleich der Taxonzuordnung von Mikrosatelliten- und SNP-Daten wurde annähernd perfekte Übereinstimmung gefunden. Schlussendlich konnte die Genotypisierungsmethode erfolgreich angewendet werden auf Proben, die aus dem Jahr 1960 stammen. Andererseits sind Studien zur Parasitengenetik viel beschränkter in Hinblick auf die Verfügbarkeit molekularer Marker. Nur wenige Parasiten können unter Laborbedingungen in den Wirtsorganismen kultiviert werden. Außerdem lässt die unverhältnismäßig kleine DNA-Menge der Parasiten im Vergleich zum Wirt und die Anwesenheit anderer Organismen im Kulturmedium wenig Alternativen zur Verwendung traditioneller Marker wie ITS (interne transkribierte Spacer). Die traditionelle Methode, Sequenzdaten zur Beurteilung der Diversität zu erhalten (Sanger-Sequenzierung gefolgt von Klonierung wegen der hohen intragenomischen Variation dieser Region) ist mittlerweile ineffizient durch den hohen finanziellen und zeitlichen Aufwand. Daher wurde eine molekulare Pipeline entwickelt, um größere Datenmengen zu produzieren und fehlerfreier zu verarbeiten unter Verwendung einer Next Generation Sequencing-Plattform (454). Anschließend wurde eine neuartige bioinformatische Pipeline ‚QRS‘ (Quantification of Representative Sequences, Quantifizierung Repräsentativer Sequenzen) entwickelt, die mithilfe von Neighbor Joining- und Parsimony-Ansätzen repräsentative Sequenzen aus Next Generation Sequencing (NGS)- Datensätzen ermittelt und deren Frequenzen berechnet. Die Methode wurde verifiziert durch den Vergleich des Datensatzes mit einer vorangegangenen Studie zur Populationsstruktur des Daphnia-Parasiten Caullerya mesnili, die auf Klonierung und Sanger-Sequenzierung basierte. Die Pipelines wurden anschließend zur Untersuchung der genetischen Diversität zweier parasitärer Mikrosporidienarten (Berwaldia und MIC1) verwendet, die häufig den Daphnia longispina-Komplex in Zentraleuropa infizieren. Besonders die Muster geografischer Populationsstruktur, intraspezifische genetische Variation und Rekombinationsereignisse wurden untersucht, da sie eine bessere Charakterisierung der Parasitenbiologie ermöglichen. Die bei Berwaldia beobachtete begrenzte geografische Variation und die Herkunft der rekombinanten und parentalen Sequenzen aus unterschiedlichen Seen unterstützt die Hypothese eines sekundären mobilen Wirts im Lebenszyklus dieser Art. Ebenso scheint MIC1 einen sekundären Wirt zu haben. Allerdings unterscheiden sich die sekundären Wirte der beiden Parasiten wahrscheinlich, wobei derjenige von Berwaldia vermutlich eine höhere Mobilität aufweist als der Wirt, der MIC1 überträgt.
Daphnia longispina species complex, SNP genotyping, ITS, species-specific SNPs, pipeline, genetic diversity, low-quality DNA
Rusek, Jakub
2016
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Rusek, Jakub (2016): Development of molecular tools to study Daphnia - parasite dynamics. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Evolutionary dynamics of hosts and their parasites are complex processes. In order to study these processes on genotype level, reliable molecular tools have to be developed. The goal of this thesis was to develop such tools for freshwater crustaceans - Daphnia longispina species complex and its parasites. On one hand, from the host side - an interspecific hybridization plays an important role. For tracing community dynamics and reticulate evolution in such a hybrid species complex, long-term comparative studies of natural populations are necessary. In order to conduct such a study, it is essential to access historical samples. These samples are usually suffering from low DNA quality due to the preservation chemical such as formaldehyde or denaturated ethanol, therefore traditional genotyping through length-based markers (such as microsatellites or allozymes) proved to be insufficient. For circumventing these issues, SNP- based markers were developed. Based on transcriptome data of one species belonging to the complex, it was possible to amplify and sequence several unlinked loci, which were then scanned for species-specific SNPs. Altogether 11 loci distinguishing all three species of the complex and their hybrids were developed and incorporated into PCR-RFLP assay. By comparing the taxon assignment from microsatellite and SNP data, there was found nearly perfect concordance. Finally, the genotyping method was successfully tested on samples dating back to the year 1960. On the other hand, parasite genetic studies are much more limited, in terms of availability of molecular markers. Only handful of parasites allows their cultivation under laboratory conditions inside the hosts. Even then, their disproportional amount of DNA compared to hosts and additional presence of other organisms present in media is forcing to rely on the traditional markers such as internal transcribed spacer (ITS). The traditional method of obtaining sequences to access the diversity (Sanger sequencing preceded by cloning – due to high intragenomic variation of this region) is becoming inefficient due to its high costs in terms of funds and time. Therefore, there was developed a molecular pipeline able to produce and process larger amount of sequence data with more accurate processing, specifically using a next-generation-sequencing platform (454). Afterwards a new bioinformatic pipeline QRS (quantification of representative sequences) was developed, inferring the representative sequences from the next generation sequencing (NGS) data sets (based on neighbor joining or statistical parsimony) and calculating their frequencies. Verification of the method was done by comparing the dataset with the previous study of population structure of Daphnia parasite Caullerya mesnili based on cloning and Sanger sequencing. Pipelines were then used for accessing genetic diversity of the two parasite microsporidian species (Berwaldia and MIC1) commonly infecting Daphnia longispina complex in Central Europe. Specifically, the patterns of geographic population structure, intraspecific genetic variation, and the recombination events were examined, which are necessary for better characterization of the biology of these parasites. The limited geographical variation that was observed in Berwaldia and the different lake origin of recombinant and parental sequences supports usage of a mobile secondary host hypothesis during the life cycle of this species. Similarly MIC1 seems to have a secondary host, however the secondary hosts of both parasites likely differ and the Berwaldia`s one is assumed to have a higher mobility than the one transmitting MIC1.

Abstract

Die evolutionäre Dynamik von Wirtsarten und ihren Parasiten beinhaltet komplexe Prozesse. Zur Untersuchung dieser Prozesse auf der Ebene des Genotyps ist die Entwicklung zuverlässiger molekularer Werkzeuge notwendig. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung solcher Werkzeuge für den Daphnia longispina-Artenkomplex (Süßwasser-Crustaceen) und seine Parasiten. Einerseits spielt auf Seiten des Wirts interspezifische Hybridisierung eine große Rolle. Um die Dynamik der Artengemeinschaft sowie die verästelte Evolution innerhalb eines solchen Hybridartenkomplexes nachzuvollziehen, sind vergleichende Langzeitstudien natürlicher Populationen notwendig. Zur Durchführung einer solchen Studie ist die Einbeziehung historischer Proben essentiell. Diese Proben haben üblicherweise den Nachteil einer niedrigen DNA-Qualität durch Konservierungsmittel wie Formaldehyd oder vergällter Ethanol. Daher erwiesen sich traditionelle Methoden zur Genotypisierung mittels längenbasierter Marker wie Mikrosatelliten oder Allozyme als unzureichend. Aus diesem Grund wurden SNP-basierte Marker entwickelt. Basierend auf Transkriptomdaten einer Art aus dem Daphnia longispina-Artenkomplex konnten mehrere ungekoppelte Loci amplifiziert, sequenziert und nach artspezifischen SNPs durchsucht werden. Insgesamt wurden 11 SNP-Marker entwickelt, die alle drei Arten und ihre Hybriden unterscheiden und mit Hilfe eines PCR-RFLP-Tests untersucht wurden. Beim Vergleich der Taxonzuordnung von Mikrosatelliten- und SNP-Daten wurde annähernd perfekte Übereinstimmung gefunden. Schlussendlich konnte die Genotypisierungsmethode erfolgreich angewendet werden auf Proben, die aus dem Jahr 1960 stammen. Andererseits sind Studien zur Parasitengenetik viel beschränkter in Hinblick auf die Verfügbarkeit molekularer Marker. Nur wenige Parasiten können unter Laborbedingungen in den Wirtsorganismen kultiviert werden. Außerdem lässt die unverhältnismäßig kleine DNA-Menge der Parasiten im Vergleich zum Wirt und die Anwesenheit anderer Organismen im Kulturmedium wenig Alternativen zur Verwendung traditioneller Marker wie ITS (interne transkribierte Spacer). Die traditionelle Methode, Sequenzdaten zur Beurteilung der Diversität zu erhalten (Sanger-Sequenzierung gefolgt von Klonierung wegen der hohen intragenomischen Variation dieser Region) ist mittlerweile ineffizient durch den hohen finanziellen und zeitlichen Aufwand. Daher wurde eine molekulare Pipeline entwickelt, um größere Datenmengen zu produzieren und fehlerfreier zu verarbeiten unter Verwendung einer Next Generation Sequencing-Plattform (454). Anschließend wurde eine neuartige bioinformatische Pipeline ‚QRS‘ (Quantification of Representative Sequences, Quantifizierung Repräsentativer Sequenzen) entwickelt, die mithilfe von Neighbor Joining- und Parsimony-Ansätzen repräsentative Sequenzen aus Next Generation Sequencing (NGS)- Datensätzen ermittelt und deren Frequenzen berechnet. Die Methode wurde verifiziert durch den Vergleich des Datensatzes mit einer vorangegangenen Studie zur Populationsstruktur des Daphnia-Parasiten Caullerya mesnili, die auf Klonierung und Sanger-Sequenzierung basierte. Die Pipelines wurden anschließend zur Untersuchung der genetischen Diversität zweier parasitärer Mikrosporidienarten (Berwaldia und MIC1) verwendet, die häufig den Daphnia longispina-Komplex in Zentraleuropa infizieren. Besonders die Muster geografischer Populationsstruktur, intraspezifische genetische Variation und Rekombinationsereignisse wurden untersucht, da sie eine bessere Charakterisierung der Parasitenbiologie ermöglichen. Die bei Berwaldia beobachtete begrenzte geografische Variation und die Herkunft der rekombinanten und parentalen Sequenzen aus unterschiedlichen Seen unterstützt die Hypothese eines sekundären mobilen Wirts im Lebenszyklus dieser Art. Ebenso scheint MIC1 einen sekundären Wirt zu haben. Allerdings unterscheiden sich die sekundären Wirte der beiden Parasiten wahrscheinlich, wobei derjenige von Berwaldia vermutlich eine höhere Mobilität aufweist als der Wirt, der MIC1 überträgt.