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Kunz, Elisabeth (2016): Feinkartierung und Kandidatengenanalyse des Weaver-Syndroms im Braunvieh. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, per Feinkartierung und Kandidatengenanalyse das auslösende Gen der Bovinen progressiven degenerativen Myeloenzephalopathie (Weaver-Syndrom) in reinrassigen Brown Swiss und Brown Swiss × Braunvieh Kreuzungen zu identifizieren. Mithilfe eines indirekten Gentests auf Basis von sechs Mikrosatellitenmarkern und durch Zuchtausschluss von Anlageträgern war es in den letzten zwei Jahrzehnten gelungen, das Auftreten neuer Erkrankungsfälle zu verhindern. Im Jahr 2013 wurden 41 diagnostische SNPs und ein Weaver-Haplotyp als neue Diagnosemethode vorgestellt, deren Anwendung zur Identifikation einer Reihe von bisher unbekannten Anlageträgern führte, die in keinem offensichtlichen Verwandtschaftsverhältnis zu den bereits bekannten Anlageträgern standen. Da das kausale Gen weiterhin unbekannt blieb, führte dieser aktuelle Anlass unter den Züchtern zu großer Unsicherheit bezüglich der populationsweiten Frequenz der Mutation und des sich daraus ergebenden Risikos eines erneuten Auftretens von Erkrankungsfällen. Grundlage für die Kartierung per kombinierter Kopplungsungleichgewichts- und Kopplungsanalyse (cLDLA) waren die Genotypen von 43 Merkmalsträgern, 31 Anlageträgern und 86 Weaver-freien Tieren. Der auf diese Weise ermittelte maximale Likelihood ratio test statistic Wert an Position 49,812,384 bp auf BTA4 und das zugehörige 0,853-Mb Konfidenzintervall waren wiederum in ein Homozygotiesegment von 1,72-Mb Größe eingebettet, innerhalb dessen Grenzen Sequenzdaten aus Run4 des 1000 Bull Genomes Project nach Sequenzvarianten durchsucht wurden. Eine Assoziation mit dem Weaver-Phänotyp, d. h. ein heterozygoter Genotyp in zwei bekannten Weaver-Anlageträgern, während die restlichen 1145 Bullen alle homozygot für das Referenzallel waren, trat dabei sowohl für einen nicht-synonymen SNP an Position 49,878,773 bp als auch für einen synonymen SNP an Position 50,858,538 bp auf, wobei letzterer jedoch außerhalb des genannten Homozygotiesegments lag. Weiterführende Untersuchungen, welche gezielte Genotypisierungen mithilfe der PCR-RFLP Methode, die Analyse von Abstammungsdaten und Beurteilungen von histopathologischen Schnittpräparaten beinhalteten, sprachen ebenfalls eindeutig gegen den SNP an Position 50,858,538 bp, wohingegen der SNP an Position 49,878,773 bp als wahrscheinlichster Kandidat für die Weaver-Mutation bestätigt werden konnte. Im Laufe der Analysen stellte sich zudem heraus, dass es sich bei sechs Merkmalsträgern um falsch positive Weaver-Fälle handelte. Erst nach Entfernung dieser Tiere aus der Fallgruppe einer parallel durchgeführten Fall-Kontroll-Kartierung, deren Ergebnisse Vergleichswerte für die cLDLA liefern sollten, konnte auch hier eine Assoziation zwischen einem chromosomalen Segment auf BTA4 und dem Auftreten des Weaver-Syndroms ermittelt werden. Die cLDLA-Methode bietet somit gegenüber Fall-Kontroll-Analysen den Vorteil, dass selbst falsch positive Tiere in der Testpopulation zu einem verlässlichen Kartierungsergebnis führen. Gleichzeitig wird eine höhere Kartierungsgenauigkeit erreicht, so dass die cLDLA für die angestrebte Feinkartierung als Methode der Wahl bestätigt wurde. Anhand einer Stichprobe von Braunvieh/Brown Swiss aus den Geburtenjahrgängen 2013 bis 2015 wurde die Frequenz des Kandidaten-SNPs an Position 49,878,773 bp in der genetisch aktiven Population geschätzt. Der dabei ermittelte Wert von 0,26 % und die statistische Erwartung von einem Fall pro 605 000 Geburten zeigen, dass die Mutation noch immer in der Population vorhanden ist und weiterhin per Populationsmonitoring verfolgt werden sollte. Ein gehäuftes Wiederauftreten von Weaver-Fällen ist jedoch nicht zu erwarten. Zwar konnte gezeigt werden, dass der Weaver-Haplotyp ebenfalls in Rassen wie Fleckvieh, Swiss Simmental und Holstein auftritt, die Mutation selbst wurde jedoch in keiner Rasse außerhalb von Braunvieh/Brown Swiss nachgewiesen. Unter Einbezug aller Ergebnisse der hier durchgeführten Analysen lässt sich zusammenfassend sagen, dass eine eindeutige Assoziation mit dem Weaver-Phänotyp nur für den SNP an Position 49,878,773 bp nachgewiesen werden konnte und es sich bei diesem nicht-synonymen Basenaustausch im Gen PNPLA8 mit hoher Wahrscheinlichkeit um die kausale Mutation handelt. Um endgültige Beweise für die Kausalität des SNP zu liefern und die Pathogenese des Weaver-Syndroms auf zellulärer Ebene detailliert aufzuklären, ist weitere Forschung notwendig.

Abstract

This thesis aimed to fine map and, if possible, identify the causal mutation behind Weaver syndrome (Bovine progressive degenerative myeloencephalopathy), a heritable neurodegenerative disorder in pure and crossbred Brown Swiss cattle. Over the last two decades, the occurrence of new cases of Weaver syndrome had been prevented through the use of an indirect genetic test based on six microsatellite markers and the consequent exclusion of Weaver carriers. In 2013, 41 diagnostic SNPs and a common haplotype were introduced as a new diagnostic tool that identified several previously unknown carriers; these new carriers, however, came from Weaver-free ancestors. Consequently, without knowledge of the causative gene, breeders were increasingly concerned about the population-wide frequency of the gene and a possible re-occurrence of Weaver cases. Based on genotypes of 43 Weaver affected, 31 Weaver carriers and 86 Weaver free animals, a combined linkage/linkage disequilibrium mapping approach (cLDLA) was conducted that led to a maximum likelihood ratio test statistic value at position 49,812,384 bp on BTA4. The corresponding 0.853-Mb confidence interval overlapped with a 1.72-Mb segment of extended homozygosity that was screened for sequence variants using whole-genome sequence data from Run4 of the 1000 bull genomes project. A perfect association with Weaver status was detected for a non-synonymous SNP at position 49,878,773 bp that was exclusively heterozygous in two official Weaver carriers, while all 1145 other bulls were homozygous for the reference allele. A second perfectly associated mutation was detected in close vicinity but outside the homozygous segment at position 50,858,538 bp. These SNPs had also been pointed out by MCCLURE et al. (2013) as two of the likeliest candidate causal mutations for Weaver syndrome. Further analyses including targeted genotyping by PCR-RFLP, assessment of pedigree records and histopathological sections, however, excluded the SNP at position 50,858,538 bp as a potential candidate. The association between the Weaver phenotype and the SNP at position 49,878,773 bp, on the other hand, was supported by the results of these analyses, which additionally revealed six phenocopies among the Weaver case group. A parallel case-control mapping approach, which was conducted to obtain comparative values for the cLDLA design, was only successful in identifying an association of a chromosomal region with Weaver syndrome after exclusion of these animals that, in hindsight, had proven to be phenocopies. The ability of the cLDLA approach to even handle false positive animals in the testing population while obtaining results at an even higher precision confirmed this approach as the method of choice for the analyses carried out in this thesis. Furthermore, the frequency of the candidate SNP at position 49,878,773 bp was estimated in a random sample of current Braunvieh/Brown Swiss born between 2013 and 2015. The relatively low value of 0.26 % and a statistically expected ratio of 1 case per 605 000 births show that the mutation is still present and should not be excluded from population monitoring. An imminent reoccurrence of large numbers of Weaver cases, however, is not to be expected. Although the Weaver haplotype was also detected in Fleckvieh, Swiss Simmental and Holstein, the mutation itself was not found in any other breed besides Braunvieh/Brown Swiss. Taking the results of all analyses into consideration, a perfect association with the occurrence of Weaver syndrome could only be proven for the SNP at position 49,878,773 bp. The non-synonymous base substitution in PNPLA8 therefore remains as the most probable cause of this heritable neurodegenerative disease. To further prove its causal character and thus enhance our understanding of the pathogenesis of Weaver syndrome, future research into the cellular mechanisms altered by the mutation is needed.