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Segerer, Felix Jakob (2016): From single-cell migration to the emergence of collective motion using microstructured surfaces. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik
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Abstract

Cell migration is a fundamental process that is essential for the development, maintenance, and functionality of multicellular organisms. A detailed understanding of the underlying mechanisms and phenomenological characteristics of cell migration is hence of central interest in life sciences. However, the bio-mechanical machinery propelling the cell is highly complex and its emergent migration patterns are difficult to grasp, even in the case of individually migrating cells. Additionally, at the scale of multi-cellular assemblies, interaction mechanisms that are not entirely understood result in long-ranged correlations and a rich set of collective phenomena in cell motion. A possible approach to break down this complexity is to restrict cell adhesion and migration to predefined areas by using micropatterning techniques. By choosing suitable pattern geometries, the degrees of freedom of the confined cells can be diminished so that specific features of cell migration can be addressed and studied selectively. Furthermore, micropatterning techniques allow to create large arrays of standardized microenvironments, thereby enabling the automated analysis of multiple experimental systems in parallel. In the course of this work, micropatterning techniques were developed and employed to systematically study single-cell migration and the emergence of collective motion in small cell assemblies. The developed micropatterning technique termed “microscale plasma-induced protein patterning” (µPIPP) is easy to implement and produces homogeneous protein patterns on various biocompatible substrates such as glass, tissue culture polystyrene, cyclic olefin copolymers, and parylene C. Moreover, the _PIPP protocol was extended to enable the formation of surface-bound protein gradients as well as of pattern designs featuring multiple proteins. Utilizing the controlled environment provided by micropatterning, we studied single-cell migration within arrays of ring-shaped microlanes. In contrast to conventional descriptions of cell migration, the resulting quasi-one-dimensional motion showed pronounced bimodality, exhibiting states of directionally persistent migration (“run states”) as well as states of localized erratic motion (“rest states”). Applying a change-point analysis based on cumulative sum statistics, the lifetimes of both states were identified to be exponentially distributed. The corresponding characteristic persistence times together with the cell velocity in the run state provided a set of parameters characterizing cell motion. By introducing cell-repellent barriers of different width into the setup, this parameter set was extended by quantifying the turning probability both in the presence and in the absence of chemical barriers. Similar to a migrational “fingerprint”, these five phenomenological measures were used to thoroughly quantify and compare the migration behavior of different cell types as well as the effect of different pharmaceutics. The corresponding results illustrate that micropattern-based assays in combination with detailed, multi-parameter assessment of cell motion have potential applications in cell biology as well as in sophisticated drug screening. In a second assay, the emergence of collective behavior in the motion of small cell assemblies was studied. As pattern geometry, we chose circles of different diameters, in which collective migration manifests in form of a coherent angular motion (CAMo) of the confined cells. Analyzing the dynamics in dependence on the number of cells, N, within a system, periods of CAMo as well as periods of disordered motion (DisMo) were identified. Both states showed exponential lifetime distributions. The persistence of CAMo was found to increase with N but exhibited a pronounced discontinuity between systems containing four and systems containing five cells. An assessment of the cell conformations within the patterns revealed that this discontinuity was accompanied by a geometric rearrangement of cells towards a configuration containing a central cell. Numerical simulations, which are based on the cellular Potts model and account for intracellular polarization as well as intercellular coupling via mechanotransduction, reproduced these features and hence confirmed our finding that the persistence of rotational states depends on the interplay of spatial arrangement and internal polarization of neighboring cells. The distinct migration states within confined environments hence provides significant insights into the local interaction rules guiding collective migration. Taken together, the results of this thesis shed new light on the process of cell migration and illustrate how the controlled and standardized microenvironments provided by micropatterning techniques can be used to systematically assess and examine cell migration on a quantitative basis. Furthermore, the introduced techniques and assays are a step towards establishing micropatterning as a standard tool for cell science.

Abstract

Zellmigration ist ein essenzieller Prozess in der Entwicklung und Erhaltung vielzelliger Organismen. Ein tiefgreifendes Verständnis der involvierten Mechanismen und phänomenologischen Charakteristika ist folglich von zentralem Interesse für die Zellforschung. Allerdings ist die involvierte Maschinerie komplex, was sich in Bewegungsmustern wiederspiegelt, die schon für vereinzelte Zellen schwer zu fassen sind. Zusätzlich führen auf der Skala größerer Zellansammlungen Interaktionsmechanismen, deren genaue Funktionsweise noch nicht geklärt ist, zu langreichweitigen Korrelationen und vielfältigen kollektiven Phänomenen in den Bewegungsmustern. Eine Möglichkeit diese Komplexität im Experiment herunterzubrechen bietet die räumliche Begrenzung der Migration durch Mikrostrukturierung. Durch die Wahl geeigneter Strukturgeometrien können auf diese Weise die Freiheitsgrade der Zellen so eingeschränkt werden, dass spezifische Merkmale der Zellmigration gezielt adressiert und untersucht werden können. Zusätzlich können mit geeigneten Techniken weite Oberflächenbereiche strukturiert werden, was die automatisierte und parallelisierte Auswertung großer Anzahlen standardisierter Einzelexperimente ermöglicht. Im Zuge dieser Arbeit wurden daher neue Verfahren zur Mikrostrukturierung entwickelt und verwendet, um Einzelzellmigration wie auch die Interaktion kleiner Zellgruppen systematisch zu untersuchen. Die hier entwickelte Mikrostrukturierungsmethode, genannt “microscale plasma-induced protein patterning” (µPIPP), ist einfach in der Anwendung und produziert homogene Proteinstrukturen auf verschiedenen biokompatiblen Oberflächen wie Glas, Zellkultur Polystyrol, Cyclo-Olefin-Copolymeren, und Parylen C. Darüber hinaus wurde das µPIPP-Protokoll erweitert, um die Generierung von oberflächengebundenen Proteingradienten sowie Strukturen bestehend aus mehreren Proteinkomponenten zu ermöglichen. Um das Migrationsverhalten von Einzelzellen zu untersuchen, wurden ringförmige Mikrostrukturen verwendet. Im Kontrast zu klassischen Beschreibungen der Zellmigration zeigte die quasi-eindimensionale Bewegung der Zellen in diesen Systemen ausgeprägte Bimodalität, alternierend zwischen Phasen persistenter Migration und Phasen der Zufallsbewegung. Durch Einführung eines Algorithmus’ zum Erfassen charakteristischer Änderungen im Migrationsverhalten wurden die typischen Lebensdauern beider Zustände bestimmt. Zusammen mit der Zellgeschwindigkeit im persistenten Zustand ergaben diese einen charakteristischen Parametersatz um das Bewegungsverhalten einer Zelle zu beschreiben. Durch das Einbinden einer zellabweisenden Barriere in das System wurde dieser noch um die Umkehrwahrscheinlichkeiten in Abwesenheit und Anwesenheit chemischer Grenzflächen erweitert. Zusammengenommen wurden diese fünf Parametern gleich einem Fingerabdruck des Migrationsverhaltens einer Zelle verwendet, um die Bewegungsmuster von Zelltypen verschiedener Invasivität und den Effekt verschiedener Pharmazeutika auf diese detailliert zu charakterisieren und zu quantifizieren. Die verwendete Untersuchungsmethode gibt somit ein umfassendes Bild des Migrationsverhaltens von Einzelzellen und hat zudem Potential im Hinblick auf die Entwicklung eines Standardverfahrens zur vergleichenden Analyse von Zellmotilität in Zellbiologie und Pharmakologie. In einer zweiten Versuchsanordnung wurde das Auftreten kollektiven Verhaltens in der Migration kleiner Zellgruppen untersucht. Hierfür wurden kreisförmige Mikrostrukturen von verschiedenem Durchmesser eingesetzt, in welchen kollektive Bewegung in der Form kohärenter Rotation aller Zellen innerhalb einer Kreisstruktur auftritt. Die Zellbewegung innerhalb der Systeme wurden in Abhängigkeit der enthaltenen Zellenanzahl untersucht, wobei immer sowohl Phasen kohärenter Rotation als auch Phasen ungeordneter Bewegung zu beobachten waren. Die Persistenz der Rotationszustände stieg dabei zwar generell mit steigender Zellenzahl an, dieser Trend wurde jedoch durch einen starken Abfall der Persistenz zwischen Systemen mit vier und Systemen mit fünf Zellen unterbrochen. Das Auslesen der relativen Zellpositionen innerhalb der Einzelsysteme zeigte, dass dieser Abfall mit einer Veränderung der Zellkonformation einherging. Numerische Simulationen basierend auf dem zellulären Potts- Modell, welche sowohl intrazelluläre Polarisation als auch interzelluläre Koppelung durch Mechanotransduktion berücksichtigen, reproduzierten diese Ergebnisse und lassen somit den Schluss zu, dass das Wechselspiel von relativer räumlicher Anordnung und der Ausrichtung der internen Polarisationsachsen benachbarter Zellen die Lebensdauer kollektiver Rotationszustande in der Zellmigration bestimmt. Die Untersuchung der verschiedenen Bewegungszustände innerhalb derMikrostrukturen gibt somit Einblick in die, der kollektiven Zellbewegung zugrundeliegenden, Interaktionsmuster. Zusammengefasst liefern die Ergebnisse dieser Arbeit somit tiefere Erkenntnis über den Prozess der Zellmigration und stellen einen weiteren Schritt dar, Mikrostrukturierung als Standardverfahren zur Analyse und Quantifizierung von Zellbewegung zu etablieren.