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Tausch, Franziska Friederike (2016): Nachweis der Einzelkomponenten B, L1 und L2 des Bacillus cereus Enterotoxin-Komplexes Hämolysin BL: Entwicklung und Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Etablierung und Anwendung von monoklonalen Antikörpern (mAk) gegen den aus den drei Einzelkomponenten B, L1 und L2 bestehenden, von B. cereus produzierten Enterotoxin-Komplex Hämolysin BL (HBL). Als Immunogen wurde eine aus B. cereus Kulturüberständen (KÜ) mittels Immunaffinitätschromatographie (IAC) gewonnene Toxinpräparation verwendet. Aus drei durchgeführten Zellfusionsexperimenten konnten insgesamt 35 Hybridomzelllinien, die HBL-Komponenten-spezifische mAk produzieren, etabliert werden. Die Charakterisierung der Antikörper erfolgte mittels Enzymimmuntests (EIA), Immunoblot und WST-Zellkulturtest. Untersuchungen zur Spezifität zeigten, dass ein Großteil der mAk (29) gegen HBL-B gerichtet ist, vier mAk reagieren sowohl mit HBL-B als auch HBL-L1, zwei mAk sind HBL-L2-spezifisch. Ein HBL-L1-spezifischer mAk konnte hingegen nicht etabliert werden. In Zellkulturtests waren die beiden HBL-L2-spezifischen mAk in der Lage, die zytotoxische Aktivität von HBL zu neutralisieren. Demgegenüber wurde für drei HBL-B-reaktive mAk ein Zytotoxizitäts-verstärkender Effekt beobachtet. Unter Verwendung der hergestellten mAk sowie mAk aus früheren Arbeiten am Lehrstuhl für Hygiene und Technologie der Milch gelang es, erstmals zum Nachweis aller HBL-Komponenten hochempfindliche Sandwich-EIAs zu entwickeln. Die Nachweisgrenzen für rekombinante Toxinkomponenten lagen dabei jeweils im unteren Nanogramm-Bereich (0,04 - 4 ng/ml). Eine Untersuchung der HBL-Produktivität von 16 hbl-positiven Stämmen zeigte, dass diese zwischen verschiedenen Stämmen zum Teil deutlich divergiert. Allerdings konnte im Hinblick auf die Expression der HBL-Einzelkomponenten bei den meisten Isolaten ein ähnliches Bild erhalten werden. In Studien zur HBL-Komplexbildung konnte mittels IAC gezeigt werden, dass in nativen B. cereus KÜ HBL-B und HBL-L1 interagieren. Da zudem alle drei HBL-Komponenten in den gereinigten Toxinpräparationen detektiert werden konnten, ist wahrscheinlich auch ein Teil des HBL-L2 an diese Komplexe assoziiert. Mit einem Hybrid-Sandwich-EIA-System, das auf der Kombination eines HBL-L1-reaktiven mAk und eines HBL-L2-spezifischen mAk basiert, sowie einem Dot Blot Assay wurde des Weiteren die Interaktion von rekombinantem HBL-L1 und HBL-L2 in Lösung demonstriert.

Abstract

This study describes the establishment and characterization of monoclonal antibodies (mAb) against each of the individual components (B, L1, L2) of the Bacillus cereus enterotoxin complex hemolysin BL (HBL). B. cereus supernatants were purified by immunoaffinity chromatography (IAC) and the resulting toxin preparations were used as immunogen. A total of 35 hybridoma cell lines, secreting component-specific antibodies were obtained from three different cell fusion experiments. The mAbs were characterized by means of enzyme immunoassays (EIA), immunoblots and cell culture assays. Specificity analyses revealed that the majority of the mAbs (29) is directed against HBL-B, while four mAbs react with both HBL-B and HBL-L1; another two mAbs are specific for HBL-L2. However, no HBL-L1-specific mAb could be established. In cell culture assays, both of the HBL-L2-specific mAbs were capable to neutralize the cytotoxic activity of the HBL-complex. In contrary, an enhanced cytotoxic effect was observed for some of the HBL-B reactive mAbs. Based on the new developed antibodies as well as other mAbs previously generated at the chair of hygiene and technology of milk, highly sensitive sandwich EIAs for the detection of each of the individual HBL-components were established. For recombinant toxin components detection limits of these assays were in the range from 0.04 to 4 ng/ml. Studies on the HBL-productivity of 16 hbl-positive B. cereus strains revealed that there is a large variation in the level of toxin expression. However, with regard to the expression of the individual HBL-components results were similar for most of the tested strains. By using IAC strong evidence was found that HBL-B and HBL-L1 interact in native supernatants. Further on, as all HBL components could be detected in the purified toxin preparations, it seems to be likely that parts of HBL-L2 are associated to those complexes as well. Interaction of recombinant HBL-L1 and HBL-L2 could be demonstrated by using both a hybrid sandwich EIA, combining a HBL-L1 reactive mAb and a HBL-L2-specific mAb, and a dot blot assay.

Abstract

Englische Übersetzung des Titels: Detection of the individual components B, L1 and L2 of the Bacillus cereus enterotoxin complex hemolysin BL: development and characterization of monoclonal antibodies