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Kunas, Christoph (2016): Schnelles semi-quantitatives Screening auf Antibiotikarückstände in Fleisch. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

In dieser Arbeit wurde der ursprünglich für den Antibiotika-Nachweis in Milch entwickelte Biosensor MCR3 für das Screening von Fleischproben auf Hemmstoffrückstände in Fleisch evaluiert, adaptiert, validiert und mit hemmstoffhaltigen Proben aus der Routinepraxis erfolgreich getestet. Die orientierende Evaluierung der Antikörper-basierten Einzelnachweise zeigte, dass in Pufferlösung alle implementierten Antibiotika (Penicillin G, Cloxacillin, Nafcillin, Cephapirin, Ceftiofur, Gentamicin, Neomycin B, Streptomycin, Tylosin, Sulfadiazin, Sulfamethazin und Enrofloxacin) zum Teil deutlich unterhalb der jeweiligen Rückstandshöchstmengen (MRLs) detektierbar sind. Bei der Adaption des Biosensor-Verfahrens an die Matrix Fleisch konnte gezeigt werden, dass eine einfache Verdünnung des Fleischsaftes (1:5 in PBS) für die Analyse ausreichend ist, und keine aufwendigen (chemischen) Extraktionsschritte nötig sind. Anstatt der Erstellung von Standardkurven wurde die wiederholte Messung eines Referenzpuffers in den Messablauf integriert, um eine sichere Hochdurchsatzmessung über 50 aufeinanderfolgende Regenerationszyklen zu garantieren. Für die Validierung des Biosensors als qualitatives (semiquantitatives) Screeningverfahren nach EU-Richtlinie 657/2002 wurden in einer Vielzahl von Analysen dotierte und hemmstofffreie Fleischsaftproben gemessen, um so die Cut-Off-Werte für die einzelnen Antibiotika festzulegen. Diese Werte wurden auf jeweils halbem MRL-Niveau (bei Cephapirin: MRL) und bei einigen sensitiveren Nachweisen zusätzlich für deutlich geringere Konzentrationen (bis zu 1/40 MRL) ermittelt. Bei diesen empfindlicheren Einzelnachweisen ermöglicht das Biosensor-basierte Analyseverfahren somit neben einer qualitativen Hemmstoffidentifizierung auch semiquantitative Aussagen über die in der Probe vorhandenen Rückstands-Konzentrationen. Belastete Fleischproben (n = 28) aus Routineuntersuchungen, deren Rückstandsbelastung am LGL Erlangen mittels LC-MS/MS identifiziert und quantifiziert worden war, wurden im Biosensor erneut getestet. Die Screeningergebnisse für diese Proben, die ein breites Spektrum von (Mehrfach-)Rückständen verschiedener antimikrobieller Substanzen enthielten, entsprachen den LC-MS/MS Analysen und belegten die praktische Anwendbarkeit der Methode. In den Proben wurden insgesamt acht Wirkstoffe zuverlässig identifiziert, der Anteil falsch-positiver Ergebnisse lag bei 2,2 %, falsch-negative Analysen traten nicht auf.

Abstract

In this study the biosensor MCR3, which was originally developed for the detection of antibiotics in milk, was evaluated, adapted and validated for the screening of meat for antimicrobial residues. Finally, the applicability of the developed screening assay was demonstrated by the analyses of incurred samples. An evaluation study of the antibody-based assays showed that each of the implemented antibiotics (penicillin G, cloxacillin, nafcillin, cephapirin, ceftiofur, gentamicin, neomycin B, streptomycin, tylosin, sulfadiazine, sulfamethazine and enrofloxacin) could be detected well below the respective maximum residue levels. Adapting the biosensor-method to the matrix meat it became apparent, that a mere dilution of meat juice (1:5 in PBS) is sufficient for the analysis and that no complex (chemical) extraction was needed. During the biosensor tests, no standard curves were established but, rather, the 50 applied repetitive analyses cycles were interspersed with measurements of a reference buffer to ensure the reliable high throughput analyses of meat samples. In order to validate the biosensor as a qualitative (semi-quantitative) screening method according to EU-directive 657/2002, a multitude of measurements of contaminated and inhibitor-free meat juice samples were carried out to determine the specific cut-off-values for each antibiotic. These values were established at 0.5× MRL values for each single antimicrobial (1× MRL was used for cephapirin) and, in addition, depending on the test sensitivity also for considerably lower concentrations (down to 1/40th MRL). Thus, besides the qualitative identification of residues, the biosensor-based screening-technique also enables semi-quantitative estimations of the residue concentrations in a sample. Incurred samples (n =28), collected during routine-screening, were analysed using LC-MS/MS at the Bavarian Health and Food Safety Authority. These samples, containing a wide range of (multiple) antibiotic residues, were retested in the biosensor. The obtained screening results matched the data obtained by the confirmatory method und thus proved the applicability of the method for real samples. Eight different substances were reliably detected in the incurred samples; the ratio of false-positive results was 2.2 %, no false-negative results were obtained.

Abstract

Englische Übersetzung des Titels: Rapid semiquantitative screening for antibiotic residues in meat