Entwicklung und Evaluierung von auf monoklonalen Antikörpern basierenden Sandwich Enzymimmuntests für den serotypspezifischen Nachweis von Cronobacter sakazakii

Scharinger, Eva Jasmin (2016): Entwicklung und Evaluierung von auf monoklonalen Antikörpern basierenden Sandwich Enzymimmuntests für den serotypspezifischen Nachweis von Cronobacter sakazakii. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät

Abstract

Eine Cronobacter sakazakii-Infektion stellt vor allem für Säuglinge ein gesundheitliches Risiko dar. Die Untersuchung von powdered infant formula (PIF) mittels standardisierter kultureller Methoden ist mit einem erheblichen Zeitund Arbeitsaufwand verbunden. Da sowohl etablierte PCR- als auch Enzymimmuntest (EIA)-Verfahren nicht den Anforderungen einer zuverlässigen und günstigen Schnellnachweismethode genügen, wurden in dieser Arbeit erstmals auf monoklonalen Antikörper (mAks) basierende Sandwich EIAs für den spezifischen Nachweis von C. sakazakii der Serotypen O1, O2, O3 und O7 und C. malonaticus Serotyp O2 etabliert. Dafür wurden zuerst alle in der Stammsammlung befindlichen Cronobacter spp.-Stämme (n=91) mittels PCR auf Genus-, Spezies- und Serotypebene charakterisiert. Ausgewählte Stämme wurden mit Polymyxin B behandelt, um das so erhaltene Protein- und LPS-reiche Lysat für die Immunisierung von Mäusen einzusetzen. Die etablierten mAks wurden mittels indirekter EIAs, Immunoblot, Immun-fluoreszenz und Motilitätsassays eingehend charakterisiert. Dabei konnten Polysaccharid- bzw. Flagellenstrukturen als antigene Determinanten identifiziert werden. Außerdem wurde die serotypspezifische Reaktion der mAks 1C4 (C. sakazakii O1), 2F8 (C. sakazakii O2), 2B7 (C. sakazakii O7) und 1E8 (C. malonaticus O2) bestätigt. Während diese mAks keine Kreuzreaktivität mit anderen Cronobacter spp. oder mit Vertretern der Familie Enterobacteriaceae aufwiesen, reagiert der mAk 1A11 aufgrund einer identischen LPS-Struktur sowohl mit C. sakazakii Serotyp O3 als auch mit C. muytjensii vom Serotyp O1. Mit allen mAks konnten in dieser Arbeit Sandwich EIAs etabliert und stammspezifische Nachweisgrenzen im Bereich von 2 × 10^3 - 5 × 10^6 KbE/ml für Reinkulturen realisiert werden. Weiterhin konnte die Anwendbarkeit der Sandwich EIAs für den Nachweis von C. sakazakii der Serotypen O1-O3 in Säuglingsnahrung demonstriert werden: niedrige Keimzahlen von bis zu 1 KbE pro 10 g künstlich kontaminierter PIF waren nach einer Anreicherung von 15 h zuverlässig nachweisbar. Somit stehen zum ersten Mal sensitive, robuste und hoch spezifische immunchemische Systeme für den Nachweis der pathogenen C. sakazakii Serotypen O1, O2, O3, O7 und des C. malonaticus O2-Serotyps zur Verfügung.

Abstract

An infection with Cronobacter sakazakii poses a health risk especially for neonates. The standardized cultural procedure for the analysis of powdered infant formula (PIF) is associated with a significant workload of up to 6 days. Since established PCR as well as enzyme immunoassay (EIA) methods cannot meet the requirements for reliable and low-priced rapid detection methods, in this study, monoclonal antibody (mAb)-based sandwich EIAs were established for the serotype-specific detection of C. sakazakii of the serotypes O1, O2, O3, O7 as well as C. malonaticus of the serotype O2. For this purpose all Cronobacter spp. strains (n=91) from the strain collection were characterized at genus-, species-, and serotype-level using PCR. Selected strains were treated with polymyxin B in order to obtain a preparation, rich in protein and LPS, which was then used for the immunization of mice. The established mAbs, all of the IgG-subtype, were thoroughly characterized using indirect EIAs, immunoblot, immunofluorescence and motility assays. Thereby, polysaccharide and flagella structures were identified as antigenic determinants. Furthermore, the serotype specific reaction of mAb 1C4 (C. sakazakii O1), 2F8 (C. sakazakii O2), 1E8 (C. malonaticus O2) and 2B7 (C. sakazakii O7) was confirmed. While these mAbs showed no cross reactivity with other members of the Enterobacteriaceae family, the mAb 1A11 showed considerable reactivity with C. sakazakii strains of the serotype O3 and C. muytjensii strains of the serotype O1, due to the same LPS structure of these serotypes. Using these mAbs, it was possible to establish sandwich EIAs, and strain specific detection limits of 2 × 10^3 - 5 × 10^6 CFU/ml in pure bacteria culture could be realized. Further on, the applicability of the sandwich EIAs for the detection of C. sakazakii of the serotypes O1-O3 in PIF was demonstrated: low bacterial cell counts of 1 CFU per 10 g artificially contaminated PIF were reliably detected after an enrichment step of 15 h. Thus, sensitive, robust and highly specific immunochemical systems for the detection of pathogenic C. sakazakii of the serotypes O1, O2, O3, O7 and C. malonaticus serotype O2 are available for the first time.

Abstract

Englische Überstzung des Titels: Development and evaluation of monoclonal antibody-based sandwich enzyme immunoassays for the serotype-specific detection of Cronobacter sakazakii

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Cronobacter, Sandwich Enzymimmuntest, serotypspezifischer Nachweis, Schnellnachweis
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 590 Tiere (Zoologie)
• Fakultäten: Tierärztliche Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 16. Juli 2016
• 1. Bericht­erstatter:in: Märtlbauer, Erwin