Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleo-cytoplasmic transport of protein and RNA

Wörner, Andreas Christian (2016): Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleo-cytoplasmic transport of protein and RNA: designed β-sheet proteins and their structural properties reveal novel toxicity mechanisms in a gain-of-function model of protein misfolding diseases. Dissertation, LMU München: Fakultät für Chemie und Pharmazie

Abstract

Protein misfolding and aggregation are linked to various forms of dementia and amyloidoses, such as Alzheimer’s, Parkinson’s, and Creutzfeldt Jakob diseases. Although the primary misfolding proteins are disease-specific and structurally diverse, the related disorders share numerous symptoms and cellular malfunctions. A sustainable cure remains so far out of reach. The highly complex nature of the associated cellular deficiencies challenges our understanding of primary causes and consequences in the disease progression. To focus on the toxic properties and pathogenic gain-of-function mechanisms of misfolded structures in cells, we applied a set of artificial β proteins directly folding into amyloid-like oligomers and fibrils. Amyloid-related proteotoxicity appeared sequence-dependently in human, murine neuronal, fungal, and bacterial cells. The interplay between elevated surface hydrophobicity and structural disorder among the β proteins and their cellular interactors was critical for toxicity. Small distributed oligomers correlated to elevated toxicity. Protein-rich plaques or misfolded assemblies appear in patients often simultaneously in different cellular compartments and in the extracellular space. To analyze site-specific toxicities and vulnerabilities, we targeted the β proteins specifically into distinct compartments. Aggregation in the cytoplasm was highly toxic and interfered with active nucleo-cytoplamsic transport in both directions, including the translocation of NF-κB and mRNA. We compared our results to human disease-associated mutants of Huntingtin, TDP-43, and Parkin, causing comparable transport defects. Remarkably, toxicity of the β proteins was strongly reduced when targeted to the nucleus. Aggregates localized in dense nucleolar foci caused no transport inhibition. Only protein aggregation in the cytoplasm led to sequestration and mislocalization of numerous proteins with extended disordered regions, including factors involved in nucleo-cytoplasmic transport of proteins and mRNA (importin α and THOC proteins). Nuclear β proteins in contrast behaved very inert, potentially being shielded by nucleolar factors such as nucleophosmin (NPM-1). In presence of cytoplasmic aggregation vital signaling processes were impaired, further destabilizing cellular homoeostasis. The mRNA accumulated in enlarged “nuclear RNA bodies”. Depletion of cytoplasmic mRNA consequently resulted in a reduction of protein synthesis. Impairment of nucleo-cytoplasmic transport caused by cytoplasmic protein aggregation may thus seriously aggravate the cellular pathology initiated by misfolding and aggregation in human amyloid diseases. Our findings suggest that novel therapeutic strategies may improve nucleocytoplasmic transport, utilize the nuclear proteostasis for aggregate removal, or increase the cellular resilience towards misfolded structures in general.

Abstract

Proteinmissfaltung und -aggregation wird mit neurodegenerativen Krankheiten wie Alzheimer, Parkinson und der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, sowie mit systemischen Amyloidosen in Verbindung gebracht. Auch wenn sich anfangs die Hauptbestandteile der Proteinaggregate krankheitsspezifisch unterscheiden, so kommt es bei den verschiedenen Demenzerkrankungen doch oft zu ähnlichen Symptomen und zellulären Fehlfunktionen. Eine nachhaltige Heilung ist bisher nicht möglich. Die Komplexität der auftretenden zellulären Fehlfunktionen erschwert eine klare Unterscheidung von primären Ursachen sowie deren Folgen und Nebenwirkungen. Um uns auf die toxischen Eigenschaften und die toxische Wirkung von missgefalteten Strukturen in Zellen zu konzentrieren, setzen wir eine Reihe von künstlichen β Proteinen ein, welche direkt amyloide Oligomere und Aggregate bilden. Die Toxizität der β Proteine trat sequenzabhängig in menschlichen, neuronalen, Pilz- und Bakterienzellen auf. Erhöhte Hydrophobie an der Proteinoberfläche und unstrukturierte Sequenzbereiche wurden als kritische strukturelle Merkmale der β Proteine und ihrer zellulären Interaktionspartner im Zusammenhang zur Toxizität identifiziert. Auch korrelierten kleinere, über das Zytoplasma verteilte Oligomere mit hoher Toxizität. Proteinaggregate treten in Patienten in verschiedenen Kompartimenten der Zelle und im extrazellulären Raum auf, oft an mehreren Stellen gleichzeitig. Um die Toxizität in verschiedenen Kompartimenten und deren Sensibilitäten zu untersuchen, schickten wir die β Proteine mittels Signalsequenzen gezielt in bestimmte zelluläre Kompartimente. Aggregation im Zytoplasma war hochtoxisch und störte den aktiven Transport zwischen Zytoplasma und Zellkern, einschließlich der Translokation von NF-κB und mRNA. Wir reproduzierten unsere Ergebnisse mit krankheitsassoziierten Mutanten von Huntingtin, TDP-43 und Parkin, welche vergleichbare Transportdefekte verursachten. Bemerkenswerterweise reduzierte sich die Toxizität der β Proteine stark, wenn sie in den Zellkern geschickt wurden. Hier sammelten sich die β Proteine in dichten Aggregaten in den Nukleoli. Dabei traten keine Transportprobleme auf. Nur Proteinaggregation im Zytoplasma verursachte (Ko-)Aggregation und Fehllokalisation zahlreicher zellulärer Proteine, besonders von solchen mit längeren unstrukturierten Bereichen. Dazu zählten auch Faktoren, welche den Transport von Proteinen und mRNA zwischen Zytoplasma und Zellkern vermitteln (Importin α und THOC Proteine). Die β Proteine im Zellkern verhielten sich im Gegensatz sehr unauffällig. Anscheinend wurden sie zusätzlich durch nukleoläre Faktoren wie Nukleophosmin (NPM-1) abgeschirmt. Aggregation im Zytoplasma beeinträchtigte die Übermittlung lebenswichtiger zellulärer Signale, was die zelluläre Homöostase weiter destabilisierte. Die mRNA hat sich dabei in vergrößerten „nukleären RNA Körperchen“ angesammelt. Die fehlende mRNA im Zytoplasma führte zu einer Abnahme der Proteinsynthese. Die von Proteinaggregaten verursachten Defekte im molekularen Transport zwischen Zytoplasma und Zellkern könnten so ernsthaft zur Verschlimmerung der zellulären Funktionsfähigkeit in neurodegenerativen und anderen Proteinfehlfaltungserkrankungen beitragen. Neue Therapieansätze könnten in einer Verbesserung des Kerntransports, in einer Verminderung von Aggregaten durch Proteostasissysteme im Zellkern, oder in einer generellen Stärkung der zellulären Resilienz gegenüber fehlgefalteten Proteinen zu finden sein.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Neurodegenerative disease, protein aggregation, cytoplasmic aggregates, nucleo-cytoplasmic transport, RNA
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
• Fakultäten: Fakultät für Chemie und Pharmazie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 11. Juli 2016
• 1. Bericht­erstatter:in: Hartl, F. Ulrich