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Su, Meng (2016): Construction and functionalization of oligonucleotides. Dissertation, LMU München: Fakultät für Chemie und Pharmazie
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Abstract

Oligonucleotides are significant tools in chemical biology and show wide applications. This thesis contains two projects concerning the construction of ligandosides and functionalization of oligonucleotides for formylcytosine detection. In the first project, a novel metal-base pair based on the pyrazole ligand was developed. The synthesis of the pyrazole ligandoside comprised the preparation of a protected base building block and a cuprate mediated C-glycosylation as the key step (Figure 1-1). The correct β-configuration of the nucleoside was confirmed by X-ray crystallography. The ligandoside precursor was incorporated into numerous oligonucleotides by automated DNA synthesis (Chapter 4.2). With a homo-pyrazole base pair inserted, duplex stability increased by 9°C after incooperation of one copper ion. The chelating performance depends on deprotonation of the phenol group of the ligandoside. Up to ten copper ions can be coordinated inside the duplex. Compared with the bridging salen base pair, the non-bridging pyrazole base pair shows a kinetical preference for complexation (Figure 1-2, Chapter 4.3). The pyrazole triphosphate is accepted by the Therminator polymerase which extends the primer. The unsatisfactory efficiency, however, hinders its application in PCR (Chapter 4.4.1). A duplex with five pyrazole-copper pairs was applied as a chiral catalyst in a model Diels-Alder reaction, which allowed to reach an ee value of 39% (Chapter 4.4.2). The novel ligandoside sheds light on how DNA may be used as a catalyst in organic reactions and enlightens further design and optimization of ligandosides. The second project is focused on developing a new fdC sequencing method based on an oligonucleotide probe connected to a hydroxylamine linker. The linker was selected using a combinational chemistry strategy. The most suitable linker at an n+4 position of the probe strand was known to react with the fdC in the target strand irreversibly. Because the probe and the target strand hybridized to form a duplex, the probe reacted with the target fdC with high positional specificity (Figure 1-3, Chapter 4.2). The reaction is limited to fdC and can tolerant single nucleotides polymorphisms in the target. Multiple fdC probes can be applied together. Enzymatic digestion and primer extension experiments were performed on the cross-linked oligonucleotide towards LC-MS and PCR detection (Chapter 4.3). After oxime formation, the duplex can be digested into dinucleotides but they cannot be detached. The probe strands hinders the Taq polymerase to pass through the target strand. A method for relative fdC quantification was developed using the described probe (Figure 1-4 Chapter 4.4). After crosslinking, the fdC probe was ligated to an adapter strand, wrapped in nanodroplets and replicated using PCR. The signals were counted and compared to a reference amplicon. 10-fold increase of fdC was observed at one position in an exon in Tdg-/- mES cells compared to Dnmt TKO cells, and 2-fold compared to Tdg+/- cells. The method can be applied to other targets of interest in order to track the dynamic change of the epigenetic fdC bases.

Abstract

Oligonukleotide sind wichtige Werkzeuge in der chemischen Biologie und erlauben breite Anwendungen. Diese Arbeit gliedert sich in zwei Projekte. Den Einbau von Metallo-Basen in DNA und die Funktionalisierung von Oligonukleotiden zur Detektion von 5-Formylcytosin. Im Zuge des ersten Projekts wird ein neues Metall-Basenpaar entwickelt, welches auf dem Pyrazolliganden basiert. Die Synthese des Pyrazolliganden erforderte die Darstellung eines geschützten Basenbausteins und eine Kuprat-vermittelte C-Glykosylierung als Schlüsselschritt (Abb.1-1). Die gewünschte β-Konfiguration des Nukleosids wurde durch eine Kristallstrukturanalyse bestätigt. Der Ligandosid- Vorläufer wurde in zahlreiche Oligonukleotide mittels automatisierter DNA-Synthese eingebaut (Kapitel 4.2). Liegt ein Homo-Pyrazol-Einzelbasenpaar in einem Strang vor, so erhöht die Zugabe von Cu2+ den Schmelzpunkt des Doppelstrangs um 9°C. Die Komplexierung hängt von der Deprotonierung des Phenols im Ligandosid ab. Duplexe mit 10 Pyrazol-Basenpaaren ermöglichte das Stapeln von bis zu zehn Kupferionen im Inneren eines Doppelstranges. Verglichen mit dem überbrückten Salen-Basenpaar, zeigte das nicht überbrückten Pyrazole-Basenpaar eine kinetische Präferenz zur Komplexierung (Abb.1-2, Kapitel 4.3). Die enzymatische DNA-Synthese erfolgt durch die Therminator Polymerase. Diese katalysiert die Polymerisation des Pyrazolnukleosid-triphosphats zu Polynukleotiden. Die unzureichende Effizienz steht weiteren Anwendungen in der PCR jedoch im Wege (Kapitel 4.4.1). Ein Duplexstrang mit fünf Pyrazol-Kupferpaaren wurde als chiraler Katalysator in einer Diels-Alder-Reaktion eingesetzt und erreicht einen ee-Wert von 39% (Kapitel 4.4.2). Der neue Ligandosid kann als DNA- Katalysator in organischen Reaktionen genutzt werden. Das zweite Projekt konzentriert sich auf die Entwicklung einer neuen Sequenzierungsmethode für fdC. Diese basiert auf einer Oligonukleotidsonde verbunden mit einem Hydroxylamin-Linker. Der Linker wurde durch kombinatorische Chemie entwickelt. Der am besten geeignete Linker an einer geeigneten Position auf dem Sondenstrang kann mit dem fdC des Zielstrangs irreversibel reagieren. Da die Sonde- und der Zielstrang zu einem Duplex hybridisieren, reagierte die Sonde mit dem erwünschten fdC mit Positionsspezifität (Abb.1-3, Kapitel 4.2). Die Reaktion ist spezifisch für fdC und toleriert Einzelnukleotid-Polymorphismus im Zielstrang. Mehrere fdC Sonden können gemeinsam angewendet werden. Enzymatische Hydrolyse und Primer-Extension-Experimente wurden an den vernetzten Oligonukleotiden durchgeführt. Dadurch konnten die Sonde durch LC-MS- und PCR-Methoden analysiert werden (Kapitel 4.3). Nach der Oximreaktion können die Doppelstränge in Dinukleotide verdaut aber nicht voneinander getrennt werden. Durch die kovalente Bindung zwischen den Sondensträngen wird die Taq-Polymerase gestoppt. Dies unterbindet die Vervielfältigung. Eine relative fdC Quantifizierungsmethode wurde mit dieser Sonde entwickelt (Abb.1-4, Kapitel 4.4). Nach der Vernetzung, wurden die fdC Sondestränge mit einem Adapterstrang ligiert, in Nanotröpfchen verteilt und repliziert. Die Signale in den Tröpfchen wurden gezählt und mit einem Referenzamplicon verglichen. So wurde in Tdg knokcout mES Zellen in Vergleich zu einem Dnmt Dreifachknockout die zehnfache Menge an fdC beobachtet und im Vergleich zu Tdg+/– Zellen die zweifache Menge. Das Verfahren kann auf eine Vielzahl von Zielen angewandet werden.