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Malinowska, Klara Helena (2016): Enzymatic activity and mechanical stability of cellulosomal components. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik
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Abstract

The work presented in this thesis consists of two lines of research, both inspired by the intricate multi-enzyme complexes called cellulosomes. Cellulosomes are extracellular machines produced by anaerobic bacteria to efficiently degrade plant cell wall polysaccharides. To this end they employ an arsenal of specialized enzymes arranged on hierarchal, multi-domain protein scaffolds by means of non-covalent receptor-ligand interactions. Cellulosomes are highly effective tools for cellulose degradation due to a range of evolutionary adaptations, including targeted substrate adhesion, intelligent substrate-adjusted enzyme composition, efficient assembly mechanisms, and enhanced mechanical properties. The first part of this thesis describes development of the novel assay for the determination of cellulolytic activity of multi-component enzyme mixtures on lignocellulosic substrates. The crucial feature of the assay is a polymerization-based amplification scheme that effectively integrates and localizes the signal in the form of an insoluble hydrogel. Quantitative readout of the amount of polymer formed is achieved in both bulk and microscale implementations, including fluorescence microscopy, turbidity measurements and scanning microscopy. When bulk readout modalities are employed, the assay enables the use of natural biomass substrates in screening applications, addressing a shortcoming of the currently used methods. Insight into cellulose degradation at the microscale is enabled by combining the assay with time-resolved imaging techniques, specifically TIRF microscopy. The second part of the work concentrates on the unique mechanical properties of cellulosomal components. Particularly, highly specific protein-protein complexes responsible for the assembly of cellulosomes are investigated. These cohesion-dockerin non-covalent links bridge bacterial host cell and cellulosic carbon sources in turbulent environments, and therefore are subject to mechanical forces in vivo. One of the strongest known receptor-ligand pairs is reported as part of this thesis. First, the complex is characterized using single molecule force spectroscopy. To this end, an improved experimental protocol was developed and implemented. Next, the mechanisms behind the exceptional mechanostability of the interaction were elucidated employing full-atom steered molecular dynamic simulations, in collaboration with the group of prof. Klaus Schulten from University of Illinois, USA. A new network based analysis of simulation trajectories is developed to visualize the force propagation paths through the protein complexes.

Abstract

In der vorliegenden Arbeit werden zwei verschiedene Forschungsprojekte vorgestellt, die bei- de von komplizierten Multienzymkomplexen, auch Cellulosome genannt, inspiriert wurden. Cellulosome sind extrazelluläre Maschinen, die von manchen Bakterien zur Zersetzung von Polysacchariden aus den Zellwänden von Pflanzen eingesetzt werden. Zu diesem Zweck verwenden sie eine Vielzahl von spezialisierten Enzymen, die mittels nicht-kovalenter Rezeptor Ligand Wechselwirkungen auf hierarchisch aufgebauten Protein Gerüsten angeordnet werden. Durch eine Reihe evolutionärer Anpassungen wie gezielter Substratanbindung, substratspezifischer Enzym Zusammensetzungen, effizienter Assemblierungsmechanismen, enzymatischer Synergieeffekte und hochangepassten mechanischen Eigenschaften sind Cellulosome hocheffektive Werkzeuge für den Celluloseabbau. In ersten Teil dieser Arbeit wird die Entwicklung eines neuartigen Assays zur Bestimmung der cellulytischen Aktivität von mehrkomponentigen Enzym Mischungen auf lignocellulosischen Substraten beschrieben. Das Kernelement dieses Assays ist ein polymerisationsbasierter Amplifikationsmechanismus der das Signal mittels eines unlöslichen Hydrogels integriert und lokalisiert. Dabei wird eine quantitative Auslese des produzierten Polymers für Makro- wie Mikroimplementationen erreicht. Dabei werden unter anderem Fluoreszenzmikroskopie, Trübungsmessungen und Rastersondenmikroskopie verwendet. Für Ensemble Auslesemethoden ermöglicht das Assay den Einsatz natürlicher Biomasse als Substrat und greift damit eine der Schwächen herkömmlicher Methoden auf. Weiter wird ein zusätzlicher Erkenntnisgewinn über die Zersetzungen von Celluolse auf der Mikroskala durch die Kombination des Assays mit Bildgebungsverfahren wie Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) ermöglicht. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit den einzigartigen mechanischen Eigenschaften cellulosomaler Komponenten. Insbesondere werden hochspezifische Proteinkomplexe, die für die Assemblierung von Cellulosomen verantwortlich sind, untersucht. Diese Komplexe formen eine nicht-kovalente Brücke zwischen bakteriellen Wirtszellen und deren cellulosischen Kohlenstoffquellen. Durch die turbulenten Umbgebungen, in denen diese Bakterien zu finden sind, unterliegen diese Bindungen in vivo hohen externen Kräften. Im Rahmen dieser Arbeit wird eine der stärksten bekannten Rezeptor Ligand Wechselwirkungen beschrieben. Zunächst wird der Komplex mittels Einzelmolekülkraftspektroskopie charakterisiert. Dazu wird ein verbessertes experimentelles Protokoll vorgestellt. Anschließend werden die zugrunde liegenden Mechanismen für die extreme mechanische Stabilität der Wechselwirkung mittels atomarer Moleküldynamik Simulationen im Rahmen einem Kollaboration mit der Gruppe von Prof. Klaus Schulten von der University of Illinois, USA beleuchtet. Dabei wird ein netzwerkbasiertes Analyseverfahren der Simulationen zur Visualisierung von Kraftpropagationspfaden durch Proteinkomplexe entwickelt.