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Dietl, Susanne (2016): Adipose tissue engineering in fibrin. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

Es besteht ein stetig wachsender Bedarf an geeigneten Implantaten in der rekonstruktiven Medizin, um Weichteildefekte adäquat ersetzen zu können. Die bisher hierbei angewendeten Wiederherstellungsmethoden, wie z.B. Lappenplastiken und künstliche Implantate, sind teilweise mit gravierenden Nachteilen behaftet. Daher werden innovative Methoden und Entwicklungen, die einen dauerhaften und autologen Weichteilersatz ermöglichen, dringend benötigt. Ziel des adipose tissue engineerings ist die Herstellung eines autologen und physiologisch funktionierenden Gewebeersatzes für Rekonstruktionen nach Gewebedefekten oder aber auch zur Bereitstellung biologischer Modelle. Die Herausforderungen im Fettgewebe Engineering sind sowohl die langfristige in vivo Volumenstabilität als auch die rasche und ausreichende Blutgefäßversorgung der Konstrukte, um eine dauerhafte Geweberegeneration zu gewährleisten. Daher war das Ziel dieser Arbeit die Herstellung eines dreidimensionalen, volumenstabilen und prä-/vaskularisierten Fettgewebekonstruktes, welches sowohl für die in vitro Forschung als auch für eine klinische Anwendung in der rekonstruktiven Medizin geeignet ist. Hierfür wurden zunächst die Adipogenesefähigkeiten von ASC nach Induktion mittels Hormoncocktail in einer konventionellen 2D-Kultur und einer 3D-Sphäroidkultur vergleichend untersucht. Die 3D-Kultur zeigte hierbei eine signifikant höhere Sensitivität gegenüber dem adipogenen Induktionscocktail. In einem modifizierten langzeitstabilen Fibringel, welches sowohl mit ASC-Einzelzellen als auch ASC-Sphäroiden besiedelt wurde, konnte für beide Zellkulturen gleichermaßen eine erfolgreiche Adipogenese nachgewiesen werden. So konnte in vitro durch die Verwendung der optimierten Fibrinmatrix besiedelt mit ASC ein volumenstabiles Fettgewebekonstrukt generiert werden. Um in diesen Konstrukten auch prävaskuläre Strukturen herzustellen, welche für einen raschen Gefäßanschluss in vivo wichtig sind, wurden unterschiedliche Fibrinmatrices mit ASC, MVEC und MVEC/ASC Co-Kulturen besiedelt. Unter Verwendung verschiedener Kulturmedien konnten in den Konstrukten keine prävaskulären Strukturen nachgewiesen werden. Es schlossen sich in vivo Untersuchungen in Mausmodellen zur Evaluation verschiedener Fibrinmatrices besiedelt mit ASC an. Es wurde die in vivo Volumenstabilität der Fibrinmatrices und die in den Konstrukten stattgefundene Adipogenese und Vaskulogenese untersucht. Es zeigte sich, dass das Fibringel mit 25 mg/ml Fibrin ausreichend volumenstabil war und zugleich Adipogenese und Vaskulogenese ermöglichte. Die vergleichenden in vivo Untersuchungen von Einzelzellen und Sphäroiden im Fibringel ergaben keine Unterschiede hinsichtlich der Fettgewebeentwicklung. Die IHC-Färbung zeigte, dass die in den Konstrukten befindlichen Fettzellen und Gefäße nicht humanen Ursprungs waren, sondern von einwandernden Wirtszellen stammten. In einer weiteren in vivo Studie wurde der Einsatz der stromal-vaskulären Fraktion als neue Zellquelle für das adipose tissue engineering zur Herstellung von vaskularisierten Fettgewebekonstrukten untersucht. Die Verwendung dieses heterogenen Zellgemisches verbesserte die Entwicklung von Fettzellen und Gefäßen im Konstrukt signifikant im Vergleich zu mit ASC besiedelten Gelen. Darüberhinaus zeigte die immunhistochemische Analyse, dass die enthaltenen Adipozyten und Gefäße von den humanen SVF-Zellen stammten. Insgesamt konnte in dieser Arbeit durch die Verwendung des optimierten Fibringels besiedelt mit SVF-Zellen erfolgreich ein artifiziell hergestelltes Fettgewebekonstrukt in vivo etabliert werden, welches an das Gefäßsystem des Wirtstieres angeschlossen war. Unseres Wissens nach ist dies das erste Mal, dass ein langzeitstabiles Fibringel besiedelt mit SVF-Zellen zu einem gut vaskularisierten mit maturen Adipozyten durchsetzten Konstrukt in vivo generiert werden konnte. Dieses Resultat könnte richtungweisend für die Entwicklung von engineerten Fettgewebekonstrukten für die regenerative und plastische Medizin sein.

Abstract

There is a tremendous demand for suitable implants in reconstructive medicine to replace soft tissue defects adequately. The previously applied restoration methods such as flaps and artificial implants are afflicted with some serious disadvantages. Thus innovative methods and developments which allow a lasting and autologous soft tissue replacement are urgently required [3, 15, 165]. The aim of adipose tissue engineering is to provide an autologous, functional tissue substitute for reconstruction purposes and to establish biological models for diagnostic and research purposes [11, 12]. The challenges in adipose tissue engineering are long-term in vivo volume maintenance as well as rapid and adequate blood supply of the constructs to ensure permanent tissue regeneration [21, 147, 166]. Hence the goal of this thesis was to develop a three-dimensional, volume stable and pre-/vascularized adipose tissue construct which is suitable for in vitro research as well as for clinical use in reconstructive medicine. After induction with a hormonal cocktail the adipogenic differentiation capability of ASC cultured in 2D-cell layers or in 3D-spheroids was compared. A significantly enhanced adipogenic response to the hormonal induction cocktail was shown for the 3D-culture model. Successful adipogenesis of single cells and spheroids was also shown by embedding ASC in a modified long-term stable fibrin with both culture forms (single cells vs. spheroids) differentiating equally in this matrix. Thus using the optimized fibrin gel and ASC volume stable adipose constructs could be developed in vitro. In order to improve the vascularization of the constructs upon implantation the development of prevascular endothelial structures in the constructs in vitro was investigated by adding MVEC and varying media composition and fibrin concentration. However no prevascular tube formation was detected under these conditions in the fibrin matrix. To evaluate the in vivo development of adipose tissue in ASC-fibrin constructs studies in a nude mouse model were performed. Thereby different fibrin formulations seeded with single ASC or spheroids were investigated with regard to volume stability and adipogenesis and angiogenesis within the construct after 4 weeks in vivo. With increasing the fibrin concentration the volume stability of the constructs was improved but as a consequence adipogenesis and vaskulogenesis was reduced. A fibrin gel formulation with 25 mg/ml fibrin turned out to provide sufficient volume stability and to sustain adipogenesis and bloodvessel formation. Comparing the performance of implanted single cells vs. spheroids in fibrin regarding adipose tissue formation no difference could be observed. The emerging adipocytes and blood vessels within the constructs in both cases were shown not to originate from the implanted ASC, but were of host-origin deriving from invading host cells. In a further in vivo study therefore the feasibility of the entire stromal-vascular fraction of adipose tissue as a new cell source for the development of vascularized adipose tissue was examined. By using this heterogeneous cell population the development of adipocytes and bloodvessels was significantly improved compared to constructs inoculated with ASC and was shown to originate from the implanted SVF cells. In conclusion, by using an optimized fibrin formulation and the SVF, a vascularized adipose tissue construct, which was connected to the host vascular system, was successfully established in vivo. To our knowledge this is the first report using long-term stable fibrin gels seeded with SVF cells that led to a vascularized and with mature adipocytes filled construct in vivo. Thus the SVF as a new alternative cell source in combination with an optimized fibrin formulation as cell carrier was shown to be highly promising for the development of vascularized adipose tissue constructs for regenerative medicine and plastic surgery.