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Strauß, Tina (2015): RNA-Seq-basierte Isolierung des Resistenzgens Bs4C aus Paprika. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie
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Abstract

Das Paprika Resistenzgen Bs4C aus Capsicum pubescens vermittelt Resistenz gegenüber Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv)-Stämmen, die den (transcription activator-like) TAL-Effektor AvrBs4 exprimieren. Vorangegangene Arbeiten ließen vermuten, dass AvrBs4 die Expression von Bs4C transkriptionell induziert. In einem “proof of principle”-Experiment, wurde Bs4C unter Verwendung eines RNA-Seq-basierten Ansatzes isoliert. Unter 68 differentiell AvrBs4-induzierten Paprikagenen war jedoch nur eines, das ausschließlich in der resistenten und nicht in der suszeptiblen Akzession induziert war und für das kein Transkript in Abwesenheit von AvrBs4 in der resistenten Akzession nachgewiesen wurde. Kopplungs- und Komplementationsanalysen bestätigten dieses Kandidatengen als das gesuchte Resistenzgen Bs4C. Im Bs4C-Promoter konnte ein Effektorbindeelement (EBE) für AvrBs4 identifiziert werden, das notwendig und ausreichend für die AvrBs4-Bindung an und transkriptionelle Aktivierung von Bs4C ist. Bindungsstudien ließen erkennen, dass zwei Nukleotidpolymorphismen in der korrespondierenden Region der suszeptiblen Akzession eine stark reduzierte Affinität (10fach) gegenüber AvrBs4 bedingen. Außerdem zeigten GUS-Studien, dass der Promoter des suszeptiblen Allels nicht durch AvrBs4 induzierbar ist. Folglich bestimmt ein Substitutionspolymorphismus von zwei Basenpaaren in den Promotoren des resistenten und suszeptiblen Bs4C-Allels über Resistenz oder Suszeptibilität gegenüber AvrBs4-exprimierenden Xanthomonaden. Bs4C kodiert für ein 164-AS großes Protein, das keine Homologie zu Proteinen mit bekannter Funktion aufweist. In silico Proteinstrukturanalysen sagen vier Transmembranhelices in Bs4C vorher und demzufolge stellt es einen neuen Typ von Exekutorproteinen dar, welcher Resistenz gegen TALE-exprimierende Xanthomonas-Stämme vermittelt. Zudem konnten Sequenzanalysen mindestens ein Homolog in C. pubescens und mindestens sieben Homologe in C. annuum identifizieren. Interessanterweise kodieren die meisten von ihnen aufgrund von Nukleotidaustauschen, Leserahmenverschiebungen und Insertions/Deletionspolymorphismen nicht für Volllängen Bs4C-ähnliche Proteine. Folglich könnten diese homologen Sequenzen duplizierte Gene repräsentieren, die nicht mehr funktional sind.

Abstract

The Capsicum pubescens gene Bs4C confers resistance to Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) strains expressing the transcription activator-like (TAL)-effector AvrBs4. Preliminary studies indicated that AvrBs4 transcriptionally activate the expression of Bs4C. In a poof-of-principle experiment we isolated Bs4C using a RNA-Seq-based approach. Among 68 pepper genes that were transcriptionally activated by AvrBs4 only one candidate gene was exclusively induced in the resistant and not in the susceptible as well as no transcript level was detectable in the absence of AvrBs4 in the resistant pepper accession. Linkage mapping and complementation assays confirmed that this candidate gene was the searched-for resistance gene Bs4C. Within the Bs4C promoter an effector binding element (EBE) for AvrBs4 was identified, that is required and sufficient for AvrBs4-binding to and transcriptional activation of Bs4C. Analysis to the corresponding region in a susceptible pepper accession revealed a two nucleotide polymorphism resulting in a lower affinity (10 fold) of AvrBs4 to the promoter region of the susceptible allele. Furthermore, transient GUS assays showed that the promoter of the susceptible allele is not AvrBs4-inducible. Thus, a 2-bp substitution-polymorphism in the promoters of the resistant and susceptible allele of Bs4C determines resistance or susceptibility to xanthomonads containing AvrBs4. Bs4C encodes for a 164-amino acid protein showing no homology to proteins with known function. In silico protein predictions revealed four potential transmembrane helices in Bs4C representing a novel type of executor protein that mediates resistance to a TALE-expressing Xanthomonas strain. Sequence analyses uncovered at least one homolog in C. pubescens as well as at least seven homologs in C. annuum. Interestingly, most of them do not encode for full-length Bs4C-like proteins due to nucleotide exchanges, frame shift or insertion-/deletion-polymorphisms. Thus, these homologous sequences could represent duplicated genes that lost their function.

Abstract

Englische Übersetzung des Titels: Isolation of the pepper resistance gene Bs4C-R by RNA-seq analysis