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Mast, Sophia Barbara (2016): Nachweis von Alicyclobacillus acidoterrestris Sporen in Fruchtsäften: Entwicklung und Charakterisierung von poly- und monoklonalen Antikörpern. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

Die acidophilen und thermoresistenten Sporenbildner des Genus Alicyclobacillus spielen aufgrund der Bildung von Fehlaromen eine wichtige Rolle als Verderbserreger von Fruchtsäften, wobei dem Guajacol-produzierenden A. acidoterrestris eine besondere Bedeutung zukommt. Um den einfachen, schnellen und zuverlässigen Nachweis von A. acidoterrestris Sporen in verschiedenen Fruchtsäften zu ermöglichen, sollten erstmals spezifische poly- und monoklonale Antikörper (pAK und mAK) entwickelt und darauf basierend hochsensitive und selektive immunchemische Nachweisverfahren etabliert werden. Um eine umfassende und verlässliche Charakterisierung der entwickelten Antikörper zu gewährleisten, wurde eine Alicyclobacillus spp. Stammbibliothek (n = 61) aufgebaut. Die Identifizierung der Isolate erfolgte nach mikrobiologischen Kriterien sowie mittels Real-Time PCR, RAPD-Analysen dienten zur weiteren Differenzierung. Ein Pool aus vier verschiedenen, mittels Paraformaldehyd inaktivierten A. acidoterrestris Stämmen wurde zur Immunisierung von Kaninchen und Mäusen verwendet. Die spezifische Bindung der induzierten pAK an die Sporen konnte mittels Immunfluoreszenz bestätigt werden. Basierend auf den generierten polyklonalen Kaninchenseren wurde ein sensitiver Sandwich Enzymimmuntest (EIA) aufgebaut, die Nachweisgrenzen lagen bei durchschnittlich 5,0 x 10^3 Sporen/ml für die DSM-Referenzstämme, sowie 2,1 x 10^3 – 3,8 x 10^4 Sporen/ml für die untersuchten 38 A. acidoterrestris Isolate. Unter Verwendung der Stammbibliothek und weiterer aerober sowie anaerober Sporenbildner konnte die hohe Inklusivität sowie Exklusivität des Verfahrens bestätigt werden: Alle A. acidoterrestris Stämme wurden als positiv erkannt, während die meisten anderen Alicyclobacillus spp. Stämme, sowie die Vertreter von Nicht-Alicyclobazillen keine Reaktivität zeigten. Anwendungsstudien zeigten die Einsetzbarkeit des pAK-basierten EIA für den direkten Nachweis von Sporen in verschiedenen Fruchtsäften. Nach 48 stündiger Anreicherung der in BAT-Bouillon verdünnten und mit 1 Spore/ml künstlich kontaminierten Proben bei 45 °C konnte in allen untersuchten Fruchtsaftsorten reproduzierbar und zuverlässig A. acidoterrestris nachgewiesen werden. Auch die 16 generierten mAK reagierten entweder in indirekten oder Sandwich EIAs z. T. hochaffin mit Sporen von A. acidoterrestris, mit Nachweisgrenzen von 5,0 x 10^2 – 4,0 x 10^5 Sporen/ml. Ein etablierter mAK-basierter Sandwich EIA wies eine hohe Inklusivität und Exklusivität auf. Mittels Immunoblot konnte für 12 mAK eine ausgeprägte Reaktivität mit Sporenproteinen gezeigt werden, die reaktiven Banden lagen bei ca. 14, 50 bzw. 66 kDa.

Abstract

The acidophilic and thermophilic spore formers of the genus Alicyclobacillus play an important role as spoilage microorganisms in fruit juices due to their ability to produce off-flavors, with the guaiacol-producing A. acidoterrestris being of utmost relevance. To facilitate the simple, rapid and reliable detection of A. acidoterrestris spores in various fruit juices, for the first time, specific poly- and monoclonal antibodies (pAb and mAb) should be developed and used to establish highly sensitive and selective antibody-based detection methods. To enable the comprehensive and reliable characterization of the generated anti-bodies, a collection of Alicyclobacillus strains (n = 61) was created. Identification of the isolates was accomplished by microbiological techniques as well as by real-time PCR, RAPD analyses were used for further differentiation. A pool of four different, paraformaldehyde-inactivated A. acidoterrestris strains was employed for the immunization of rabbits and mice. The specific binding of the induced pAb to spores could be confirmed by immuno-fluorescence. Based on the developed polyclonal rabbit antisera a sensitive sandwich enzyme immunoassay (EIA) was established, limits of detection were approximately 5.0 x 10^3 spores/ml for the DSM reference strains and ranged from 2.1 x 10^3 – 3.8 x 10^4 spores/ml for the evaluated 38 isolates of A. acidoterrestris. The high inclusivity and exclusivity of the EIA system could be corroborated by analyzing the Alicyclobacillus collection and other aerobic and anaerobic spore formers: All A. acidoterrestris strains were detected positive, whereas most of the other Alicyclobacillus spp. as well as the non-Alicyclobacillus strains showed no reactivity. Performance studies demonstrated the applicability of the pAb-based EIA for the direct detection of spores in a variety of fruit juices. After incubation of the samples - diluted in BAT broth and contaminated artificially with 1 spore/ml – for 48 h at 45 °C, A. acidoterrestris spores could be detected reliably and reproducibly in all tested fruit juice types. Furthermore, the generated 16 mAb showed high affinities for spores of A. acidoterrestris either in indirect or sandwich EIAs, with detection limits of 5.0 x 10^2 – 4.0 x 10^5 spores/ml. High inclusivity and exclusivity values were determined for an established mAb-based sandwich EIA. Immunoblot assays illustrated the distinct reactivity of 12 mAb with spore proteins, the reactive bands had apparent molecular weights of 14, 50 and 66 kDa.

Abstract

Englische Übersetzung des Titel: Detection of Alicyclobacillus acidoterrestris spores in fruit juices: generation and characterization of poly- and monoclonal antibodies